斑點叉尾鮰出血性敗血癥的病原鑒定及藥敏試驗

張超 莫延敬

摘要：【目的】明確重慶市萬州區某養殖場斑點叉尾鮰暴發出血性敗血癥的病因，為實際生產中有效防控該病提供參考依據。【方法】通過常規的細菌分離純化、生理生化試驗、16S rDNA序列和cpn60基因檢測、系統進化分析及動物回歸感染試驗對病原菌進行鑒定，并采用K-B藥敏紙片擴散法進行病原菌藥敏試驗。【結果】從患病斑點叉尾鮰的肝臟、腎臟、脾臟和腦組織中分離獲得1株優勢菌（WZ1906），革蘭氏染色呈陰性，短桿狀，兩端鈍圓;其菌落表面光滑濕潤，邊緣整齊，直徑大小為1～2 mm，呈灰白色至淺黃色;有運動性，氧化酶反應、V-P反應、精氨酸雙水解酶試驗均呈陽性，能發酵葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖，能水解明膠和七葉靈，產生吲哚。WZ1906菌株16S rDNA序列和cpn60基因的核苷酸序列均與嗜水氣單胞菌相關基因的核苷酸序列高度同源，其相似性達100%;從基于16S rDNA序列和cpn60基因核苷酸序列相似性構建的系統發育進化樹也可看出，WZ1906菌株與嗜水氣單胞菌聚為一支。以WZ1906菌株回歸感染的斑點叉尾鮰均發病死亡，其體表和鰭條基部出血，肝臟、腎臟和脾臟腫大充血，腸道出血，與自然發病斑點叉尾鮰的癥狀相似，但未觀察到明顯的腸套疊癥狀。WZ1906菌株對苯唑西林、大觀霉素、克拉霉素、氯霉素、四環素、諾氟沙星、環丙沙星、多粘菌素B、復方新諾明及呋喃妥因等28種藥物敏感，對青霉素G、氨芐西林和頭孢噻吩已產生耐藥性（不敏感）。【結論】引起重慶市萬州區某養殖場斑點叉尾鮰出血性敗血癥的病原菌是嗜水氣單胞菌，可選用恩諾沙星、氟苯尼考或復方新諾明等水產類常用抗菌藥物進行防治。在實際生產過程中應定期對養殖水體進行養護，科學投喂，從根本上預防斑點叉尾鮰腸套疊的發生，降低其防治難度。

關鍵詞： 斑點叉尾鮰;嗜水氣單胞菌;出血性敗血癥;腸套疊;16S rDNA序列;cpn60基因

中圖分類號： S941.429? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）09-2287-09

Identification and drug sensitivity test of the pathogen of channel catfish manifested as hemorrhagic sepsis

ZHANG Chao， MO Yan-jing

（Chongqing Three Gorges Vocational College， Wanzhou， Chongqing? 404155， China）

Abstract：【Objective】The research was conducted to clarify the etiology of hemorrhagic sepsis of channel catfish in a farm in Wanzhou， Chongqing， and provide reference for the prevention and treatment of the disease in production.【Method】The pathogenic bacteria were identified through routine bacterial isolation and purification， physiological and biochemical tests， 16S rDNA sequence and cpn60 gene detection， phylogenetic analysis and animal regression infection test. The K-B drug susceptibility disc diffusion method was used to carry out the drug susceptibility test of the pathogen. 【Result】One dominant strain（WZ1906） was isolated from the brain， liver， kidney and spleen of the diseased channel catfish. The isolate was Gram-negative， rod-shaped， both ends were obtuse; the surface of the colony was smooth and moist， with smooth edges， with a diameter of 1-2 mm， off-white to light yellow. The bacteria were motile. Oxidase reaction， V-P reaction and arginine double hydrolase test were positive， the glucose， sucrose， maltose， and lactose could be fermented， gelatin and esculin could be hydrolyzed， indole test was positive. 16S rDNA and cpn60 gene sequencing results had the highest homology with Aeromonas hydrophila， up to 100%. It could also be found that the WZ1906 strain and A. hydrophila clustered together from phylogenetic trees constructed based on the similarity of the 16S rDNA and cpn60 gene sequence. The channel catfish with recurrent infections all fell onset and died. The body surface and the base of the fin rays were congested， the liver and kidneys were enlarged and congested， and the intestinal bleeding. The symptoms were similar to those of the naturally occurring diseased channel catfish， but no obvious symptoms of intussusception were observed. The results of drug susceptibility test showed that the bacteria were sensitive to 28 drugs such as oxacillin， spectinomycin， clarithromycin， chloramphenicol， tetracycline， norfloxacin， ciprofloxacin， polymyxin， enrofloxa-cin， compound trimethoprim and nitrofurantoin， but not sensitive to penicillin G， ampicillin and cefotaxime. 【Conclusion】The pathogen causing channel catfish hemorrhagic sepsis in a farm in Wanzhou， Chongqing is A. hydrophila. Commonly used aquatic antibiotics such as enrofloxacin， florfenicol and compound trimethoprim can be used for prevention and treatment of disease. In the actual production process， the aquaculture water body should be maintained regularly and the fish should be fed scientifically to fundamentally prevent the occurrence of channel catfish intussusception and reduce the difficulty of disease prevention.

Key words： Ictalurus punctatus; Aeromonas hydrophila; hemorrhagic sepsis; intussusception; 16S rDNA sequence; cpn60 gene

Foundation item：National Natural Science Foundation of China（31602201）;Science and Technology Research Project of Chongqing Municipal Education Commission（KJQN201903506）

0 引言

【研究意義】斑點叉尾鮰（Ictalurus punctatus）又稱溝鯰（Channel catfish），是一種原產于北美洲的大型淡水魚，隸屬于鯰形目（Siluriformes）鮰科（Ictaluri-dae），因具有適應性廣、食性雜、抗病力強、生長快及肉質鮮美等優點，已成為我國主要的名特優水產品之一（李林等，2012;嚴朝暉等，2013）。但隨著集約化養殖水平的不斷提高，各種病害頻繁發生，不僅制約斑點叉尾鮰的健康養殖，還給養殖戶帶來巨大經濟損失（韋昌用等，2014;劉韜等，2016;楊移斌等，2017）。因此，分離鑒定病原微生物并采取有效的防控措施對保障斑點叉尾鮰產業健康發展具有重要意義。【前人研究進展】近年來，從斑點叉尾鮰上分離獲得的細菌病原有嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydro-phila）（周碧君等，2004;童桂香等，2009）、嗜麥芽寡養單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）（耿毅等，2006;汪開毓等，2006）、愛德華氏菌（Edwardsiella ictaluri）（梁萬文等，2007）、柱狀黃桿菌（F1avobacterium columnare）（劉禮輝等，2008）、魯氏耶爾森菌（Yersinia ruckeri）（范方玲等，2010）、鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii）（顧澤茂等，2010）、溫和氣單胞菌（A. sobria）（韋昌用等，2014;楊移斌等，2017）和維氏氣單胞菌（A. veronii）（劉韜等，2016;田浪等，2018）。其中，鮑曼不動桿菌病主要表現為肝臟發白;愛德華氏菌病的典型癥狀為頂骨出現裂縫;魯氏耶爾森菌病的典型特征為鰾出血;柱狀黃桿菌感染主要引起鰓組織腐爛;嗜麥芽寡養單胞菌及其他氣單胞菌屬病原菌感染的主要癥狀為全身廣泛性出血。從臨床癥狀來說，除鮑曼不動桿菌外，其他各類病原均能引起斑點叉尾鮰不同程度的出血癥狀，且常伴有腸套疊現象，給疾病治療帶來極大困難。2009年美國阿拉巴馬州西部和密西西比州東部養殖的斑點叉尾鮰發生大面嗜水氣單胞菌原發性感染，造成數千噸的商品魚死亡（Jubirt et al.，2015;Zhang et al.，2016a）。此外，李艷和等（2010）從患病斑點叉尾鮰中分離獲得5株病原菌[3株嗜水氣單胞菌和2株豚鼠氣單胞菌（A. caviae）];Mohammed和Peatman（2018）研究發現副乳鏈球菌（Streptococcus parauberis）、腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）和維氏氣單胞菌混合感染斑點叉尾鮰的現象。可見，2種或2種以上病原菌混合感染在斑點叉尾鮰養殖中較普遍，對其病害診治和防控提出了新挑戰，在生產實踐中應引起高度重視。針對魚類細菌性疾病，目前生產上主要采用外用消毒劑結合內服抗菌藥物的方法進行治療，而預防此類疾病的根本措施是保持良好的水質環境。【本研究切入點】出血性敗血癥是近年來斑點叉尾鮰養殖過程中的常見病害，其主要癥狀表現為全身廣泛性出血，并發腸套疊，但不同地區的病原分離鑒定結果差異明顯。2019年6—7月重慶市萬州區某養殖場的斑點叉尾鮰在雨后出現大量死亡，臨床癥狀表現為頭部和鰭基部出血，內臟廣泛性出血，伴有嚴重的腸套疊現象，為典型的細菌性感染;病魚平均體重85.0 g/尾，7日內死亡量從開始的2～3尾劇增至200多尾，病程持續1個多月，累積死亡率為30%～40%，與已報道斑點叉尾鮰細菌性疾病的癥狀和病程（蔡焰值等，2010;Zhang et al.，2016b;Abdelhamed et al.，2017;Baumgartner et al.，2017）存在差異，因此有必要進一步明確其發病原因并科學用藥治療。【擬解決的關鍵問題】對重慶市萬州某養殖場患出血性敗血癥的斑點叉尾鮰進行病原菌分離鑒定及藥敏試驗，旨在查找出斑點叉尾鮰的發病原因，為實際生產中有效防控該病提供參考依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

患病斑點叉尾鮰取自重慶市萬州區某養殖場;健康斑點叉尾鮰購自當地水產品市場，暫養7 d后，隨機挑選健康斑點叉尾鮰進行回歸感染試驗。普通營養瓊脂培養基、革蘭氏染色液、藥敏檢測試劑盒及細菌微量生化鑒定管等購自杭州天和微生物試劑有限公司;細菌基因組DNA提取試劑盒、DNA回收試劑盒和DNA Marker購自寶生物工程（大連）有限公司。

1. 2 病原菌分離純化

無菌操作下挑取典型癥狀病魚的肝臟、腎臟、脾臟和腦組織，劃線接種于普通營養瓊脂培養基上，28 ℃恒溫培養箱中倒置培養24～48 h，挑選形態大小一致的優勢菌落，重復劃線傳代2～3次純化培養。純化后的菌落轉移至普通營養瓊脂斜面培養基上，4 ℃冰箱保存備用（楊移斌等，2017）。

1. 3 病原菌形態特征觀察及其生理生化特性鑒定

參照革蘭氏染色說明進行染色，光學顯微鏡下觀察病原菌的形態特征。同時，參照細菌生化微量鑒定管說明和《常見細菌系統鑒定手冊》（東秀珠和蔡妙英，2001）對病原菌進行生理生化特性鑒定。

1. 4 16S rDNA和cpn60基因序列分析

使用細菌基因組DNA提取試劑盒提取待檢菌株的DNA。16S rDNA序列擴增引物設計參照Ucko等（2002）、石存斌等（2009）的方法，上游引物為5'-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3'，下游引物為5'-AAG GAGGTGATCCAGCCGCA-3'。PCR反應體系50.0 μL：10×PCR緩沖液5.0 μL，MgCl2（25 mmol/L）5.0 μL，dNTP（10 mmol/L）0.8 μL，上、下游引物（20 μmol/L）各0.5 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）1.2 μL，DNA模板5.0 μL，無菌雙蒸水補足至50.0 μL。擴增程序：94 ℃預變性10 min;94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，進行30個循環;72 ℃延伸10 min。cpn60基因擴增引物設計參照Mi?ana-Galbis等（2009）的方法，上游引物為5'-GAAATYGAACTG GAAGACAA-3'，下游引物為5'-GTYGCTTTTTCC AGCTCCA-3';PCR反應體系及擴增程序同16S rDNA序列。PCR擴增產物以1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，膠回收后克隆至T載體上，并挑選陽性質粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序結果與GenBank已公布的參考序列進行BLAST比對分析，利用ClustalX 1.81進行多重序列匹配和聚類分析，并以MEGA 4.0的鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構建系統發育進化樹。

1. 5 回歸感染試驗

選取60尾健康斑點叉尾鮰（平均體重85.0 g/尾）隨機分為4組（2組為攻毒組，2組為對照組）。調整菌懸液濃度至1.0×108 CFU/mL，攻毒組每尾斑點叉尾鮰胸鰭基部注射0.2 mL菌懸液，對照組則注射等量生理鹽水。攻毒后將試驗魚置于水溫25～30 ℃的養殖箱中飼養，每天觀察并記錄其發病及死亡情況，持續觀察2周。同時對瀕臨死亡或已死亡試驗魚再次進行剖檢和病原菌分離鑒定。

1. 6 藥敏試驗

采用K-B藥敏紙片擴散法進行病原菌藥敏試驗。取1.0×108 CFU/mL菌懸液0.2 mL均勻涂布于普通營養瓊脂培養基上，等距離貼上不同藥物的藥敏紙片，28 ℃恒溫培養箱倒置培養24 h后觀察并記錄抑菌圈直徑，根據藥敏紙片說明判定其敏感性。

2 結果與分析

2. 1 自然發病特點及臨床癥狀

重慶市萬州某養殖場的斑點叉尾鮰在雨后發病，發病時池塘平均水溫30 ℃，7日內的發病死亡量從開始的2～3尾劇增至200多尾，病程持續1個多月，累積死亡率為30%～40%。臨床癥狀：病魚的頭部、口腔和胸鰭基部出血，眼球突出（圖1-A）;剖檢可見肝臟暗紅，腎臟和腸道充血，脾臟腫大呈醬黑色，腸壁稀薄，腸套疊嚴重（圖1-B），呈典型的敗血癥癥狀。

2. 2 病原菌的形態特征

從患病斑點叉尾鮰的肝臟、腎臟、脾臟和腦組織中均能分離到菌落形態特征一致的單一株菌，命名為WZ1906。其菌落呈圓形，灰白色至淺黃色，表面光滑濕潤，邊緣整齊，直徑大小為1～2 mm（圖2）。革蘭氏染色呈陰性，短桿狀，兩端鈍圓，為單個或成對排列，無芽孢和莢膜（圖3）。

2. 3 病原菌的生理生化特性

由表1可知，WZ1906菌株具運動性，其氧化酶反應、V-P反應、精氨酸雙水解酶試驗均呈陽性，能發酵葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖，能水解明膠和七葉靈，產生吲哚。WZ1906菌株的生理生化特性與嗜水氣單胞菌TE090214株（童桂香等，2009）和AHIA04株（李艷和等，2010）相似。

2. 4 16S rDNA和cpn60基因序列分析結果

16S rDNA序列和cpn60基因的PCR擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，分別得到約1500和750 bp的清晰目的條帶（圖4），與預期結果相符。獲得的序列經BLAST比對分析，結果顯示，16S rDNA序列和cpn60基因的核苷酸序列均與嗜水氣單胞菌相關基因的核苷酸序列高度同源，其相似性達100%。從基于16S rDNA序列和cpn60基因核苷酸序列相似性構建的系統發育進化樹（圖5和圖6）均可看出，WZ1906菌株與嗜水氣單胞菌聚為一支。

2. 5 回歸感染試驗結果

攻毒組斑點叉尾鮰在人工攻毒感染2 d后，出現活力下降、游動無力現象，其體表和鰭條基部出血（圖7-A），5 d內的累計發病魚占攻毒總數的90%，而注射無菌生理鹽水的對照組斑點叉尾鮰未見任何異常（表2）。剖檢發病死亡斑點叉尾鮰可見肝臟、腎臟和脾臟腫大充血，腸道出血（圖7-B），與自然發病斑點叉尾鮰的癥狀相似，但未觀察到明顯的腸套疊癥狀。再次分離獲得的菌株與WZ1906菌株的形態特征、生理生化特性及16S rDNA和cpn60基因序列分析結果一致，說明WZ1906菌株即為斑點叉尾鮰出血性敗血癥的致病菌。

2. 6 藥敏試驗結果

35種抗菌藥物的敏感試驗結果（表3）表明，WZ1906菌株對苯唑西林、大觀霉素、克拉霉素、氯霉素、四環素、諾氟沙星、環丙沙星、多粘菌素B、復方新諾明及呋喃妥因等28種藥物敏感，對青霉素G、氨芐西林和頭孢噻吩已產生耐藥性（不敏感）。

3 討論

I型伴侶蛋白cpn60為高度保守蛋白，近年來常用于物種系統進化分析及種間鑒定。已有研究表明，采用cpn60基因序列對氣單胞菌屬細菌的鑒定效率明顯高于16S rDNA序列（Hill et al.，2004;Mi?ana-Galbis et al.，2009;Guo et al.，2016;Navarro and Martíne-Murcia，2018）。本研究對分離自患出血性敗血癥斑點叉尾鮰的WZ1906菌株進行分子生物學鑒定，分別擴增其16S rDNA序列和cpn60基因，經BLAST比對分析，發現16S rDNA序列和cpn60基因的核苷酸序列均與嗜水氣單胞菌相關基因的核苷酸序列高度同源，其相似性達100%。從基于16S rDNA序列和cpn60基因核苷酸序列相似性構建的系統發育進化樹也可看出，WZ1906菌株與嗜水氣單胞菌聚為一支。綜合WZ1906菌株的形態特征、生理生化特性及回歸感染試驗結果，可確定嗜水氣單胞菌即為斑點叉尾鮰出血性敗血癥的致病菌。

嗜水氣單胞菌在自然界的分布十分廣泛，隸屬于弧菌科（Vibrionaceae）氣單胞菌屬（Aeromonas），為典型的條件致病菌，且多為繼發感染，是淡水魚類細菌性敗血癥的主要病原，幾乎能侵染所有的淡水魚類，給水產養殖業造成巨大經濟損失（Ardó et al.，2010;王權和朱光來，2012;Zhang et al.，2016a）。此外，從各地患出血癥斑點叉尾鮰檢測出的致病菌存在明顯差異。在貴州烏江（周碧君等，2004）和廣西天峨（童桂香等，2009）檢測出的致病菌為嗜水氣單胞菌;在四川成都檢測出的致病菌為嗜麥芽寡養單胞菌（耿毅等，2006）;在廣西龍州（韋昌用等，2014）、湖北仙桃（楊移斌等，2017）和貴州羅甸（田浪等，2018）等地檢測出的致病菌為溫和氣單胞菌;在河南中牟檢測出的致病菌為維氏氣單胞菌（劉韜等，2016）;在湖北省宜都和長陽檢測出愛德華氏菌和嗜水氣單胞菌混合感染（劉堂水等，2006）;在安徽富煌則發現是嗜水氣單胞菌和豚鼠氣單胞菌混合感染（李艷和等，2010）。本研究從重慶市萬州某養殖場患出血性敗血癥的斑點叉尾鮰中分離獲得嗜水氣單胞菌，結合貴州烏江（周碧君等，2004）和廣西天峨（童桂香等，2009）兩地斑點叉尾鮰的發病時間（2—3月），推測本病例是投喂量變化引起的繼發感染，而美國斑點叉尾鮰暴發的嗜水氣單胞菌病為原發性感染（Zhang et al.，2016a）。可見，不同養殖模式下斑點叉尾鮰對氣單胞菌屬的致病菌均具有易感性，但不同地區的病原流行種類及其他流行病學存在明顯差異。

本研究的藥敏試驗結果表明，分離自患出血性敗血癥斑點叉尾鮰的嗜水氣單胞菌對頭孢哌酮、卡那霉素、氧氟沙星、恩諾沙星、諾氟沙星及復方新諾明等藥物敏感，與周碧君等（2004）、童桂香等（2009）、李艷和等（2010）的研究結論基本相同。童桂香等（2009）研究發現斑點叉尾鮰嗜水氣單胞菌對氨芐青霉素、頭孢唑林、頭孢拉定、慶大霉素、土霉素、四環素和氟苯尼考已產生耐藥性;李艷和等（2010）研究表明斑點叉尾鮰嗜水氣單胞菌對青霉素、氨芐青霉素、慶大霉素、卡那霉素、頭孢膚肟、四環素、先鋒霉素V和先鋒霉素VI等藥物不敏感（耐藥）。在本研究中，斑點叉尾鮰嗜水氣單胞菌對大多數抗菌藥物敏感，僅對青霉素G、氨芐西林和頭孢噻吩具有耐藥性，究其原因可能是菌株區域性差異所致（陳言峰等，2014）。2019年9月農業農村部發布了最新的《水產養殖用藥明白紙》，僅有12種抗菌藥物可用于食用水生動物的養殖生產，即氟苯尼考、甲砜霉素粉、恩諾沙星粉、氟甲喹粉、硫酸新霉素粉、鹽酸多西環素粉、維生素C磷酸酯鎂、鹽酸環丙沙星預混劑、復方磺胺二甲嘧啶粉、復方磺胺甲噁唑粉、復方磺胺嘧啶粉和磺胺間甲氧嘧啶鈉粉;而氯霉素、克拉霉素、萬古霉素、克林霉素、諾氟沙星、氧氟沙星、呋喃妥因、呋喃唑酮、利福霉素、頭孢唑啉、頭孢噻吩、頭孢哌酮、頭孢噻肟及頭孢曲松等藥物在水生食品動物中已禁止使用。因此，斑點叉尾鮰嗜水氣單胞菌的臨床防治宜選用氟苯尼考、恩諾沙星或復方磺胺甲噁唑粉等藥物。

在實際生產中，養殖品種單一、池塘負載過高、水質惡化及飼料營養配比不合理等均是造成疾病頻發的主要因素（陳昌福，2007;安樹偉等，2019）。單純的嗜水氣單胞菌感染防治并不困難，但并發或繼發嚴重腸套疊時給治療帶來極大挑戰。在本研究中，自然發病斑點叉尾鮰的典型特征為嗜水氣單胞菌感染并發腸套疊癥狀，但回歸感染的斑點叉尾鮰并未出現與自然發病相似的腸套疊癥狀，與童桂香等（2009）的研究結果相似。結合相關文獻報道及臨床案例分析，推測魚類腸套疊癥狀是魚類體質、飼料、養殖環境及病害等綜合因素影響的結果，因此，在實際生產過程中應定期對養殖水體進行養護，科學投喂，從根本上預防魚類腸套疊的發生。

4 結論

引起重慶市萬州區某養殖場斑點叉尾鮰出血性敗血癥的病原菌是嗜水氣單胞菌，可選用恩諾沙星、氟苯尼考或復方新諾明等水產類常用抗菌藥物進行防治。在實際生產過程中應定期對養殖水體進行養護，科學投喂，從根本上預防斑點叉尾鮰腸套疊的發生，降低其疾病防治難度。

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（責任編輯 蘭宗寶）