布魯氏菌毒力因子及致病機制研究新進展

秋葉紅，李靜波，李 響，翟景波，3

（1.內蒙古民族大學 醫學院，內蒙古 通遼028000；2.通遼市科爾沁區婦幼保健院，內蒙古 通遼028000；3.內蒙古自治區布魯氏菌病防治工程技術研究中心，內蒙古 通遼028043）

布魯氏菌是胞內寄生的革蘭氏陰性球狀桿菌，可以引起以生殖系統疾病為主要特征的人畜共患病，在全世界廣泛分布，目前該病波及了我國25個省（市、自治區），每年感染的羊、牛、豬高達百萬頭，造成的經濟損失可達十幾億元人民幣.布魯氏菌侵入人體后，可累及多個組織器官形成慢性感染，難以治愈.筆者從布魯氏菌毒力因子和致病機制兩個方面，對布魯氏菌的研究進展進行綜述.

1 毒力因子

1.1 脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）

普遍認為LPS是一種毒力因子，根據有兩點：（1）布魯氏菌LPS免疫原性差，不能激活補體系統，使其能夠在吞噬細胞內存活繁殖；（2）LPS缺陷突變株對補體和多粘菌素B介導的溶菌作用較為敏感.Anne等研究證實，去除WboA基因的牛種布魯氏菌變異株，其毒力要比原代菌株S2308明顯減弱.布魯氏菌S2308株的光滑型LPS具有潛在的免疫調節活性［1]，LPS分子可以不被巨噬細胞降解，并和MHC-II類分子形成復合物，維持布魯氏菌在宿主巨噬細胞中長期生存.LPS分子的完整性決定了布魯氏菌的毒力和胞內生存機制.

1.2 BvrR/BvrS雙組分調控系統

布魯氏菌雙組分調控系統可以通過感應和處理環境信號來發揮調控作用，是一類重要的毒力調控系統.BvrR/BvrS 缺失突變株導致布魯氏菌復制能力下降，不能有效抑制吞噬小體和溶酶體的融合，從而使細菌在進入細胞后被吞噬溶酶體消滅，BvrR/BvrS 雙組分調控系統能夠阻止溶酶體融合.另外，該系統可以增強布魯氏菌在營養缺乏的環境中的生存能力，使其能在細胞內長期存活.

1.3 Cyclic-1-2-glucans（CβG）

布魯氏菌CβG屬Ⅱ型滲透調節的周質葡聚糖（osmoregulated periplasmic glucans，OPGS）家族.CβG通過作用于巨噬細胞表面的脂質筏，影響細胞內的物質運輸，這些葡聚糖參與吞噬體-溶酶體融合的控制.CβG缺失的突變體無法阻止吞噬體-溶酶體融合，使細菌不能繁殖.此外，經CβG處理的突變體能夠通過避免溶酶體融合來控制空泡成熟，使布魯氏菌存活并到達內質網進而在此復制［2].

1.4 尿素酶（Urease）

尿素酶是一種金屬蛋白酶，它將尿素分解為碳酸和氨形式，從而使pH值增加，此特征使其能夠在酸性環境中存活［3].由1MB的DNA分離的染色體Ⅰ中有兩個尿素-操縱子：ure-1和ure-2.ure-1和ure-2編碼結構基因為尿素A、尿素B、尿素C和輔助基因：尿素D、尿素E、尿素F、尿素G［4].當布魯氏菌通過口服途徑進入宿主體內時，尿素酶可以保護其通過消化道［5].除牛種布魯氏菌外的所有種屬的布魯氏菌都會產生尿素酶［6].

1.5 細胞色素氧化酶

細胞色素氧化酶是一種可以促進布魯氏菌在巨噬細胞內存活的酶.由于在巨噬細胞內氧的利用受到限制，細胞色素cbb3氧化酶在體外表達［7]，并且能夠使布魯氏菌在缺氧組織中定植.細胞色素bd（ubiquinol oxidases）氧化酶在細胞增殖的過程中表達，在細胞復制的過程中對復制的微環境起到調節作用.缺乏此類細胞色素bd氧化酶的布魯氏菌，在感染小鼠模型中高度衰減.

1.6 烷基過氧化氫還原酶（AhpC，AhpD）

這種酶起到防御氧自由基和活性氮的作用［8].在啟動子的控制下，AhpC 和AhpD 被同一個操縱子調控.AhpC突變體對過氧化物滅活更加敏感而且更容易發生自發突變［9，3].

1.7 一氧化氮還原酶（Nord）

布魯氏菌內的一氧化氮還原酶由四種類型的還原酶組成：NNR-亞硝酸鹽還原酶，NAR-硝酸鹽還原酶，NOR-一氧化氮還原酶和NOS-一氧化二氮還原酶.一氧化氮還原酶的產生有助于保護布魯氏菌免受巨噬細胞內低氧環境的影響［3].

1.8 布魯氏菌毒力因子A（Brucella virulence factor A，bvfA）

bvfA是僅在布魯氏菌屬中產生的周質蛋白，在基因序列數據庫中沒有同源序列.吞噬細胞酸化誘導bvfA表達，由此可推測該蛋白參與復制細胞內環境.目前bvfA的功能尚不明確［10].

1.9 T4SS

T4SS是由VirB操縱子編碼的多蛋白復合物家族.布魯氏菌入侵機體時T4SS能夠調控大量毒力因子的誘導表達，產生多種效應子（VceA、VceC［11]等），有效地阻止溶酶體與吞噬小體融合，使布魯氏菌適應不良的宿主胞內環境，克服和逃避巨噬細胞的各種防御機制，進而在吞噬細胞內生存復制.

1.10 外膜蛋白

外膜蛋白是布魯氏菌重要的抗原和毒力因子，特別是在粘附侵襲過程中起到了重要作用.Omp19能夠穩定布魯氏菌外膜蛋白結構［11]，Omp25 是布魯氏菌外膜的結構蛋白，與肽聚糖（PG）相關密切，其分子量大小為20KDa.使布魯氏菌S2308、16M 和LSU99 的Omp25基因缺失，得到的缺失突變株，免疫BALB/c小鼠，并與野毒株比較.結果顯示，野毒株的體內外存活能力及激發體液免疫能力均明顯高于突變株，說明Omp25是布魯氏菌的重要毒力基因［13].有報道稱，Omp25與引發流產有關［14].Omp31 是布魯氏菌的另一免疫保護性抗原，它具有維持外膜完整性的作用，同時也是一種潛在的血紅素利用蛋白，與布魯氏菌對鐵的攝取有關.

1.11 應激反應蛋白

布魯氏菌可以表達應激反應蛋白，用來適應不良的胞內環境，從而能夠在巨噬細胞內生存繁殖.其中已經證實的應激反應蛋白有如下幾種：

1.11.1 抗氧化物歧化酶SOD、H2O2酶 研究表明［15]，SOD在活體巨噬細胞內起作用.Fred M等人通過對牛種布魯氏菌S2308毒力株和S19疫苗株Cu/Zn-SOD基因缺失研究表明，變異株在HeLa 細胞和J774細胞系中的存活和生長能力與它的親本株相同，接種在BALB/c小鼠后，S19變異株恢復了向膜內感染的能力，而S2308 變異株接種BALB/c 小鼠與親本株比較，其脾的重量明顯輕于野生株感染鼠，這些結果表明，抗氧化物歧化酶在布魯氏菌存活和致病性方面有主要功能.

1.11.2 熱休克蛋白 dnaK是一種熱休克蛋白和分子伴侶，參與毒力因子的折疊和正確定位，具有修復蛋白的作用，有助于布魯氏菌適應胞內惡劣環境.gorEL基因是一種分子伴侶，能夠參與新生蛋白的正確折疊.周質蛋白酶HtrA是外周胞質的應激反應蛋白，阻礙高溫及氧化劑對細菌的殺傷.該基因與逃避白細胞殺傷、在巨噬細胞中的復制及其毒力有關.

1.11.3 QS QS是一種細菌胞間信號傳遞系統，可以協調基因的表達，從而使細菌適應胞內環境、產生毒力因子.布魯氏菌也含有QS系統，有VjbR和BlxR兩個LuxR轉錄激活因子.胞內生存和小鼠體內存活實驗表明，VjbR突變株在巨噬細胞內的生存能力下降，毒力減弱，與Rambow 等研究結果相符.另外，文獻報道［16]VjbR 也可以通過調控鞭毛調控子FtcR 來調控鞭毛基因的轉錄.這些結果表明，QS與布魯氏菌的毒力基因表達密切相關，可以通過對菌體信號作出應答，從整體水平上調控細菌的各種毒力因子.

2 致病機制

2.1 侵入巨噬細胞

在調理狀態下，布魯氏菌主要通過Fc 、補體或纖連蛋白受體被巨噬細胞攝取.而未受調理作用的布魯氏菌通過已知和未知的受體分子（如FcR，C3Br）結合到細胞膜分泌位點，再通過脂質筏侵入巨噬細胞.布魯氏菌感染巨噬細胞后，可激活cAMP蛋白激酶A途徑，這對于布魯氏菌在巨噬細胞內的生存及復制是必需的［17].有文獻報道［18]，與野生株相比，BvrS/BvrR 突變株雖然可以與細胞結合，但是進入細胞的效率卻明顯降低.此外，當BvrS/BvrR 突變株的外膜結構發生改變并伴有外膜蛋白Omp25 和Omp22 的缺失以及脂多糖（LPS）的缺陷時，細菌即喪失入侵細胞的能力.這說明，BvrS/BvrR 雙組分系統參與布魯氏菌對吞噬細胞的侵襲［19，20].

2.2 侵入胎盤滋養層細胞

孕期婦女體內的布魯氏菌與胎盤滋養層細胞表面的熱休克蛋白70結合，其表面的IFN-γ可促進胎盤滋養層細胞對布魯氏菌的吞噬作用［21]，布魯氏菌在胎盤滋養層細胞中大量生長繁殖，感染胎盤使其完整性遭到破壞，最終產下帶菌胎兒，嚴重者可導致流產.目前對胎盤滋養層細胞中的布魯氏菌的致病形態還處于探索階段.一些反芻動物可以在感染布魯氏菌后產生糖醇類物質，刺激細胞內的布魯氏菌生長和繁殖.

2.3 形成布氏小體（BCV）

布魯氏菌毒力株侵入巨噬細胞后，吞噬小泡與巨噬細胞內的早期內吞網絡相關環節發生相互作用，激活Rho家族的小GTP酶和中度募集絲狀肌動蛋白，通過巨噬細胞上的某些受體分子使布魯氏菌發生內化，這一過程持續30 min左右［22].布魯氏菌此時定居在含有溶酶體相關膜糖蛋白及內質網標志物SecG1B陽性的囊泡中.大約1h以后，通過獲得溶酶體相關膜蛋白LAMP21逐漸形成含布魯氏菌的囊泡［23].感染4h后，巨噬細胞募集的一些抗菌因子已經殺滅近90%侵入巨噬細胞內的布魯氏菌，僅有約10%能在巨噬細胞內生存、復制.這些幸存的布魯氏菌在吞噬體內與內質網（ER）持續作用.感染24h后，含布魯氏菌的吞噬體與ER的部分膜成分交換，獲得ER的部分膜成分后成為BCV，極好的抵御了最初定位的細胞內的酸性環境，更加有利于布魯氏菌長期生存和復制.

2.4 抑制巨噬細胞的活化和凋亡

布魯氏菌感染巨噬細胞時，一方面通過阻斷主要致炎細胞因子TNF-α分泌［24]，阻止感染巨噬細胞自分泌和旁分泌殺菌活性物質，這使得布魯氏菌可以在天然免疫的炎癥階段由于TNF-α的缺乏而產生免疫耐受或偏移的特異性免疫應答.此外，通過提高細胞內cAMP的含量來抑制人巨噬細胞的活化.另一方面通過誘導抗凋亡基因A1的表達及激活凋亡抑制劑cAMP 和CREB 等方法，抑制巨噬細胞的凋亡［25].從而利用巨噬細胞內的營養物質生存復制，逃脫免疫系統的攻擊.

3 結語

本文綜述了布魯氏菌毒力因子與致病機制的研究進展，布魯氏菌含有多種不同的毒力因子，在感染過程中，毒力因子使抗原提呈細胞的吞噬能力降低，幫助布魯氏菌在吞噬細胞和非吞噬細胞中生存繁殖.巨噬細胞是布魯氏菌感染的靶細胞，布魯氏菌通過攻擊宿主單核巨噬細胞，削弱巨噬細胞的殺傷功能，使巨噬細胞的抗原提呈功能部分喪失，通過改變抗原提呈細胞的內環境，長期存在于細胞中復制和繁殖，引發慢性感染.隨著分子生物學技術的發展，布魯氏菌的致病機制在分子水平上將會有更深入的成果.明確布魯氏菌的致病機制有助于相關疫苗的研發，進一步實現布魯氏菌病的預防與治療.