線粒體潛在靶向治療及相關蛋白最新研究進展

白婷婷，趙 明

（1.內蒙古民族大學 蒙醫藥學院，內蒙古 通遼028043，2.內蒙古民族大學 附屬醫院 心內科，內蒙古 通遼028000）

心血管疾病（Cardiovascular Diseases，CVD）是老年人群死亡的主要原因之一，近年來其發病和死亡率不斷攀升［1].處理急性心肌梗死，在臨床上再灌注治療可挽救梗死區域，也常會引起缺血-再灌注損傷（Ischemia Reperfusion Injury，I/R）.腺苷三磷酸（Adenosine Triphoshate，ATP）缺乏被認為是始動環節，而ATP由線粒體合成，因此，線粒體主宰心肌細胞，與I/R息息相關.對于線粒體而言，它屬于一種動態的細胞器，在人體心肌生長過程中，都離不開它，它能夠提供必需的能量.在線粒體氧化磷酸化之后，會形成大量的ATP，在人體所有ATP中占有90%的比重，為心肌細胞的運動提供必需的能量.除了生產ATP外，線粒體還可調節一系列細胞信號，如細胞分裂、線粒體信號傳導通路、胞內代謝途徑調節、Ca2+信號通路傳導等［2]；同時它們也是活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）的主要來源，ROS可操縱氧化應激反應，從而影響細胞功能［3].線粒體中Ca2+和活性氧濃度又是許多心血管疾病的基礎，其功能障礙是致病過程中關鍵因素之一［4].

1 線粒體動力學蛋白

線粒體通常被描述為孤立地細胞器，但它們實際上形成了高度動態的網絡.這些盤根錯節的網絡本質取決于線粒體分裂和融合歷程當中的平衡［5-6]. 線粒體融合包括線粒體融合蛋白、視神經萎縮蛋白.線粒體分裂主要是受線粒體動力蛋白1（Dunamin-related Protein1，Drp1）調控，Drp1 是一種胞質蛋白，受其他各種蛋白的影響下，最主要聚集趕往線粒體中，開始分裂過程［7].接收分裂消息動作命令時，線粒體外膜上Fis1、Mff等蛋白集結Drp1快速進入線粒體中，引起線粒體分裂［8].缺氧復氧階段時，心肌細胞周期蛋白激酶（Cyclin-Dependent Kinases1，CDK1）、鈣調磷酸酶能夠提高Drp1的含量，線粒體分裂加快，進而心肌細胞開始瓦解壞死.如果降低CDK1的含量，磷酸化動力相關蛋白的磷酸化水平就會降低，從而緩解心肌壞死的速度［9].因此，線粒體動力學的一系列相關變化，對于維持其本身的完整性，以及適應細胞生命活動過程均顯得尤為重要.線粒體融合、分裂有助于去除和降解目標.然而，線粒體極度地融合與分裂會迫害細胞的代謝能力［10].

2 線粒體動力學在I/R損傷中的潛在靶向治療

在醫學不斷探索的今天，大批的實驗人員探索出I/R與線粒體功能障礙密不可分，線粒體結構和功能破壞，存活的心肌細胞持續減少，出現I/R.可能與如下原因相關：ATP合成銳減，能量不足；Ca2+和ROS的積累，其超負荷可加深線粒體損傷.以上均可能影響再灌注的臨床效果.急性心肌梗死時，不同種因素導致線粒體受損，給予治療后，線粒體功能破壞積聚.治療I/R的潛在途徑主要通過心血管細胞中的線粒體動力學改變，如蛋白質相關轉運、減少電子之間交換、防止線粒體通透性轉換孔（Mitochondrial Permeability Transition Pore，mPTP）通道開啟或激活線粒體鉀離子通道等.

2.1 線粒體DNA和蛋白質轉運

在線粒體中，分布著1000多種蛋白質，對于這些蛋白質而言，基本都由細胞核DNA進行編碼，然后進入細胞核糖體完成合成階段，再依次輸送到線粒體內膜、外膜、基質或者是膜間隙內.此外，對于線粒體DNA負責編碼的13種蛋白質，也經歷上述過程［11].無論是線粒體DNA（mtDNA），還是核DNA（nDNA）具有遺傳欠缺，均引發線粒體功能問題.mtDNA是環狀螺旋排列的雙鏈DNA分子.mtDNA排列緊密，其內含子序列不多，因此DNA序列利用的效率較高.一旦mtDNA發生變異，特別容易累及基因組一些重要區域的運行，導致嚴重后果［12].對于mtDNA，大部分位于線粒體內膜上，距離氧化磷酸化、ROS的生成位置很近，因此，常常被ROS、自由基攻擊，從而導致遺傳轉錄過程終止［13].

線粒體中蛋白質轉運系統，涵蓋了各個方面.在很多方向都發揮著十分重要的作用，比如，ATP消耗、氧化還原、分子伴侶等各種不同因素［14].在這一作用機制的影響下，蛋白質被轉運至線粒體中.此外，對于mtDNA負責編碼的蛋白質而言，也是利用此種方式進入到線粒體內膜上.mtDNA編碼線粒體微小部分蛋白，核糖體中完成，為呼吸鏈組成部分，分布在線粒體內膜上［15]，當它們向線粒體內膜轉運物質時，一般需要OXA復合物（Oxidase Assembly，OXA）負責介導.此種介導物質包括以下幾個部分，分別為Oxa1、Mba1、以及Mdm38.Oxa1負責把線粒體DNA負責編碼的蛋白質轉運到內膜之中.對于Mba1，它在Mdm38中完成蛋白整合過程，然后轉運至線粒體內膜的基質內部［16-17]. 核基因組編碼的線粒體蛋白可促進mtDNA的復制［18].Chen 等［19]通過研究發現，當大鼠心臟出現衰竭時，一般會伴隨著mtDNA的耗損，它會改變線粒體的結構、增加ROS 的生成速度，當大量的ROS 聚集到一起時，會對電子傳遞呼吸鏈、mtDNA 帶來不利的影響，逐漸陷入惡性循環之中，由此可知，mtDNA損耗也許是發生心血管疾病的重要標志.

對于心血管系統來說，轉運系統對于維持心肌細胞的生物活性相當重要，任何損壞都可能導致細胞功能障礙和死亡［20].蛋白質轉運途徑與mtDNA已被用于引導蛋白質進入線粒體的特定靶向序列［19].某種特定蛋白質的缺陷或轉運途徑的缺失均可能導致心肌細胞的功能喪失.因此，mtDNA及線粒體蛋白質轉運系統是許多疾病分子機制的關鍵，它也為靶向導入的蛋白質或其轉位酶治療心血管疾病提供新的策略.

2.2 線粒體外膜

線粒體本身的結構對其正常運行至關重要，所以每個結構也是潛在的治療靶點.內外兩層膜把其變成緊閉結構.每個線粒體由兩個特殊的膜組成細胞器，線粒體外膜（Outer Mitochondrial Membrane，OMM）和包圍基質的線粒體內膜［21].OMM是一種相對簡單的磷脂結構可滲透到小分子和離子；0MM也是ROS的主要來源.在I/R 或心力衰竭時，心臟處于慢性神經激素和外周血流動力學壓力下，兒茶酚胺升高，導致單胺氧化酶（Monoamine Oxidase，MAO）誘導的ROS 生成增加.MAO 主體加速兒茶酚胺與生物胺的氧化脫氨反應，據報道，5-羥色胺（5-Hydroxytryptamie，5-HT）在I/R 過程中積累，促進心肌損傷及加重進展過程［22].MAO介導細胞凋亡的一個機制可能是其依賴的ROS產生導致Bax/Bcl-2比值發生變化和線粒體細胞色素c釋放增加，導致心肌細胞凋亡［23].在研究中，Kaludercic等［24]提出MAO增強了小鼠主動脈收縮時的去甲腎上腺素（Norepinephrine，NE）代謝，這也與氧化應激加劇、心室擴張和收縮功能降低有關.線粒體MAO的靶向性及其潛在的治療作用是可對抗氧化應激和線粒體功能障礙誘導的細胞死亡，同時可減少因I/R損傷引起的心肌損傷［21].這些觀察為線粒體MAO 在這些疾病發展過程中提供了證據，并為其提供治療潛力.

電壓依賴性陰離子通道（Voltag e-dependent Anion Channel，VDAC），遍及散布正在哺乳動物線粒體外膜.VDAC與其他蛋白有很多相似之處，都是由核基因負責編碼，然后從核糖體中合成的.VDAC可上調線粒體外膜表達，與其他離子跨膜轉運等相同［25].受線粒體介導的心肌細胞凋亡過程，一般包含OMM、胞漿蛋白，例如，己糖激酶（Ⅰ和Ⅱ）、Bcl-2 蛋白家族等等，能夠顯著影響細胞損傷過程［26-29].利用VDAC 與mPTP之前的作用機制，來控制Bcl-2家族蛋白的抗凋亡過程［30].據研究報道，對于大鼠心臟灌注現象，主要與Bcl-XL 結構域中的細胞透性肽存在很大的關聯性，可關閉VDAC 并阻止VDAC 介導的細胞色素C 的釋放及減少心肌細胞的死亡［22].己糖激酶（HK）-VDAC 是另一種作用于OMM 蛋白的活性酶，它提供了一個有趣的靶點來選擇性地抵抗氧化損傷.HK 和VDAC 之間的聯系對OMM 滲透起到保護作用，并對細胞凋亡產生抵抗作用［30-31].有報道稱，通過HK 關閉VDAC 可以防止mPTP 的開放和阻止細胞凋亡［32].在正常條件下，在心臟I/R 損傷的小鼠模型中部分敲除HK-Ⅱ，會直接導致細胞死亡的增加［33].HK-Ⅱ與線粒體結合，能有效降低Bcl-2 家族與OMM 結合，及收縮ROS 產生，一起促成I/R 改善和恢復.研究表明，線粒體HK 的影響在促進細胞存活方面起著關鍵作用.因此，針對其與線粒體的結合，可以提供一種新的策略來增強心血管疾病的治療模式.

2.3 線粒體內膜

線粒體內膜（Inner Mitochondrial Membrane，IMM）是位于線粒體外膜內側，包裹著線粒體基質的一層單位膜.線粒體內膜中蛋白質和磷脂的質量比較高，其中含有大量的心磷脂.IMM只允許某些小分子（主要是離子）通過.IMM的主要磷脂成分心磷脂，同時也調節細胞色素C的釋放［34].在許多病理條件下，心磷脂受損也會導致心血管疾病異常.Paradies 等［35]報道稱，在I/R 心臟線粒體中觀察到的心磷脂含量與復合體Ⅰ活性的下降稱平行關系.最近有人提出，將復合物Ⅳ作為一種減輕I/R 損傷的治療靶向可能會使結果惡化，其中原因是p66Shc介導的ROS 生成細胞色素C 水平降低［36].因此，抑制線粒體p66Shc表達是治療氧化應激增加導致的動脈粥樣硬化、I/R 損傷和心力衰竭的新方向.

在IMM中，還分布著腺嘌呤核苷酸轉運體（Adenine Nucleotide Translocator，ANT），經常與VDAC共同作用，在mPTP形成過程中發揮著重要的調控作用.ANT已被證明是氧化和亞硝基應激的重要靶點. 另一個潛在的合作伙伴是線粒體肌酸激酶（Creatine Kinase，CK），它與其他酶一起是磷酸轉移網絡的一部分.ANT活性的破壞可導致ATP/ADP反轉運蛋白活性的抑制、過量ROS的產生、胞漿ATP的耗竭和線粒體去極化和凋亡［37].在臨床上，ANT 功能障礙被認為與擴張型心肌病有關［38].因此，在細胞損傷過程中，保護ANT 功能完整性為針對該蛋白的藥理學或分子遺傳學提供一個獨特的機會，進一步保護線粒體功能.

離子通道動態調節的改變是線粒體相關功能異常的基礎.mCa2+通過鈣離子通道在很大程度上取決于線粒體跨膜電位（Mitochondrial Trans-membrane Potential，△Ψm）.這種mCa2+攝取可能對線粒體功能產生深遠的影響，如改變細胞呼吸等.然而，在心臟I/R中觀察到的高濃度的mCa2+會損害ATP合成，導致離子穩態的紊亂，刺激ROS的產生，mPTP的開放，基質腫脹和OMM的破裂［39].以上因素都會導致△Ψm崩潰，信號分子（細胞色素c、AIF和Smac/Diablo）的釋放，以及ROS產生的加劇，導致線粒體功能下降，最終導致細胞死亡.△Ψm大約是肌膜電位的兩倍，這為選擇性地靶向線粒體提供了獨特的機會.線粒體的這獨特屬性被用來指導所謂的“線粒體”藥物靶向機制［40].但是這些藥物在臨床中減輕心血管異常的有效性及特異性還有待確定.

2.4 線粒體通透性轉換孔

線粒體通透性轉換孔（Mitochondrial Permeability Transition Pore，mPTP），多數坐落于線粒體內外膜，是一種非特異性復合通道，包含著多個蛋白質，屬于非選擇性孔隙，是線粒體內外信息交流關鍵，線粒體參與細胞生存與凋亡的一個關鍵方面是對其開口的控制［41].近年研究發現線粒體功能障礙和mPTP密切相關，mPTP在細胞存活和死亡中的雙重作用對于選擇性靶向孔以進行治療干預尤為重要.最近的證據表明，在低電導狀態下，孔隙可能有助于細胞溶膠和基質之間的小代謝物交換，這一過程主要由線粒體溶質載體控制［42].研究表明，在病理情況下，mPTP 的開放是由過量的mCa2+、ROS 產生引起的，而腺嘌呤核苷酸、Mg2+則限制了孔的開放［43].mPTP在缺血期間處于關閉狀態，孔洞被最小化，但在再灌注條件下，如增加的基質Ca2+和ROS 濃度則有利于孔洞持久的開放.I/R時，ROS和Ca2+激增會導致線粒體損傷，進而引發過度自噬，這一現象加深正常降解，增加損害程度［44].它的開放范圍與灌注損傷程度息息相關，標志著心肌損傷從可逆結果轉變為不可逆階段.mPTP 使線粒體通透性發生改變，造成線粒體膜電位降低、氧化磷酸化去偶聯、線粒體腫脹和細胞色素C等促凋亡因子釋放出來，從而引發細胞出現凋亡或者壞死現象［45].所以，通過減小mPTP的開放程度，或者是提高mPTP的關閉能力，有助于保護心肌細胞.Argaud等［46]研究表明，在兔活體心肌缺血再灌注模型中，缺血后處理能抑制心肌危險區域Ca2+誘導的mPTP 開放，同時提出鈣超載減輕、ROS生成減少可能與延遲mPTP 的開放有關.對mPTP開放的抑制將會增加細胞內NO含量、Ca2+超載及氧化應激等，但其中的機制還待進一步研究.

mPTP的這些作用適用于大多數細胞損傷的情況，減少線粒體通透性轉換孔開放的藥物制劑在某種程度上對心肌細胞線粒體可產生保護作用［47].最近報道，體內異氟醚誘導的后處理部分通過輕度抑制線粒體呼吸、去極化以阻止mPTP的開放以及基質pH的酸化.這些事件更好地保存線粒體生物活性，并減少Ca2+超載和細胞死亡［48].在疾病發展過程中，實現對mPTP的控制是心血管治療的一個重要目標，以及在早期損傷后最大限度地補救途徑.

3 展望

隨著研究的加深和相關領域的擴展，線粒體動力學和心血管疾病的聯系已得到重視，其對心肌細胞的代謝、信號傳導、凋亡等均有重要的調節作用.事實上，線粒體動力學的多樣性預示著廣泛的應用前景，目前許多研究集中在開發線粒體靶向藥物上，這些藥物可以在不影響細胞其他部分的情況下積聚在線粒體中.線粒體靶向治療將提供更高的效率和選擇性，但仍有很多科學問題待解決，如藥物如何精準輸送和可能出現的不良反應等，這些技術將需要隨著時間的推移而改進和完善.我們還需進一步研究其結構，全面了解作用機制，為臨床治療提供更多依據.