玉米粉中伏馬毒素B1和B2基體參考物質的研制

孟佳佳 郭文博 張志岐 王松雪 聶冬霞 葉 金郭大凱 王 敏 趙志輝 徐劍宏 韓 錚*

（1上海市農業科學院，上海市奉賢區 201403；2國家糧食和物資儲備局科學研究院，北京市西城區 100037；3中國農業科學院，北京市海淀區 100081；4江蘇省農業科學院，江蘇省南京市 210014）

伏馬毒素主要是由串珠鐮刀菌（Fusarium moniliforme）、輪狀鐮刀菌（Fusarium verticilllioides）等在一定溫濕度條件下產生的次級代謝產物。迄今為止，已發現幾十種伏馬毒素，其中最重要的是伏馬毒素B1（Fumonisin B1，以下簡稱為FB1）和伏馬毒素B2（Fumonisin B2，以下簡稱為FB2）[1]，其具有神經毒性、免疫毒性、器官和組織毒性、生殖毒性、致癌性等，且國際癌癥研究中心把伏馬毒素列為2B級致癌物[2-3]。

目前，伏馬毒素的主要檢測方法為酶聯免疫法、液相色譜串聯質譜法、衍生化后液相色譜熒光檢測等，但不同實驗室甚至同一實驗室采用不同的檢測方法，對同一樣品的分析結果之間存在明顯差異，量值很難統一，難以確保不同實驗室檢測結果的可比性[4]。同時，基體參考物質是具有高度均勻性、良好穩定性和量值準確性的一種計量標準，有利于克服由于基體效應所引起的誤差，從而保證檢測結果的準確性和量值的可溯源性，且其可用于校準儀器、驗證檢測方法及實驗室的質量控制等[5]。此外，由于FB1和FB2的標準品溶液與被FB1和FB2污染的小麥和玉米樣品之間存在較大的差異，其進入人和動物體內的生理活性、生物轉化路徑及毒性強弱均不一致，從而導致其代謝、毒理研究結果的不可靠，而基體參考物質在性質上、基體組成上與實際樣品一致。因此，采用基體參考物質替代純真菌毒素標準品溶液進行此方面的研究更具有應用價值及指導意義。但是，目前國內尚未有FB1和FB2基體參考物質及其制備方法的報道。在此背景下，本研究擬以相關國家標準以及ISO導則[6-10]為指導，研制玉米粉中FB1和FB2的基體參考物質，以期能對玉米粉中伏馬毒素的檢測、毒理代謝等研究起到促進作用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

Waters超高效液相色譜儀、串聯三重四級桿質譜儀Warters TQS（美國Warters公司），Heraeus Multifuge X3高速離心機、Thermo Scientific Heraguard ECO 超凈臺（美國Thermo Fisher scientific公司），霉菌培養箱（上海精宏實驗設備有限公司），SX-500高壓滅菌鍋（日本TOMY公司），水浴氮吹儀（青島路博環保儀器公司），DWH三維混合機（上海德越粉體機械有限公司）。

PDA粉末（北京陸橋技術有限責任公司），甲醇、乙腈（美國Merck公司，色譜純），醋酸銨（美國Aladdin公司，色譜純），FB1標準品（50μg/mL）和FB2標準品（50 μg/mL）（Sigma-Aldrich公司，St. Louis，MO，USA)。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）：稱取40.0 g PDA粉末于1 L蒸餾水中，121 ℃高壓滅菌20 min備用。

玉米培養基：稱取50 g玉米粉至 250 mL三角瓶，加入20 mL蒸餾水混勻，用透氣封口膜密封瓶口，浸泡過夜，高壓滅菌（121 ℃，20 min），冷卻后將玉米粉搖散待用。

玉米粉（經檢測不含FB1和FB2）購于上海大型超市，串珠鐮刀菌由上海市農業科學院農產品質量標準與檢測技術研究所提供。

1.2 分析方法

1.2.1 樣品前處理

準確稱取2.00±0.01 g待檢樣品，置于50 mL離心管中，加入10.0 mL乙腈-水溶液（50/50，v/v）作為提取劑，渦旋混合30 s，浸泡5 min，超聲提取1 h，4 000 r/min離心10 min。取上清液過0.22 μm濾膜，用甲醇-水溶液（20/80，v/v）稀釋10 000倍后，采用超高液相色譜-質譜聯用技術 (UPLC-MS/MS）進行檢測。

1.2.2 色譜條件

色譜柱：Agilent Poroshell 120EC-C18（100 mm × 3.0 mm，2.7 μm）（Agilent，CA，USA）。

流動相：A相為甲醇溶液；B相為5 mmol/L醋酸銨水溶液。

梯度洗脫：0～0.5 min，10%A；6 min，90%A；6.5 min，90%A；6.7 min，10%A；8 min，10%A；流速為0.4 mL/min；進樣量3 μL；柱溫40 ℃。

1.2.3 質譜條件

采用電噴霧正離子掃描模式（ESI+），脫溶劑氣、錐孔氣均為高純氮氣，碰撞氣為高純氬氣，脫溶劑溫度為500 ℃，離子源溫度為150 ℃，錐孔氣流和脫溶劑氣流分別是7.0 L/h和1 000 L/h，通過多反應監測（MRM）模式對目標化合物準確定量，FB1和FB2的母離子、子離子、碰撞能量等參數見表1。

表1 FB1和FB2的質譜條件參數

1.3 參考物質的制備

1.3.1 菌株的活化

將串珠鐮刀菌菌株接種在PDA培養基上，28℃黑暗條件下培養5 d，備用。

1.3.2 菌株的發酵培養

用無菌打孔器在菌落上取直徑為0.5 cm的菌絲塊，將菌絲塊接種至玉米培養基中，用無菌透氣封口膜密封，置于28 ℃黑暗條件下培養4周。接種第1周，每天振蕩三角瓶1次，使菌絲與培養基充分接觸。

1.3.3 基體參考物質制備

培養結束后，將錐形瓶中的產毒培養基取出置于烘箱50 ℃烘干，打碎成粉末過60目篩后，將含有高濃度FB1和FB2的玉米培養基粉末封存在自封袋中待用。稱取上述制備得到的含有高濃度FB1和FB2的玉米培養基粉末，與空白玉米粉（經檢測無FB1和FB2）均勻混合，逐級稀釋，制備獲得玉米粉中FB1和FB2基體參考物質。選用鋁箔袋，將制備好的玉米粉中FB1和FB2基體參考物質抽真空分裝，每個包裝50 g，密封100個包裝，置于-20 ℃保存。

1.4 均勻性檢驗

按照JJG 1006-1994[6]和JJF 1343-2012[7]的相關規定，從制備獲得的FB1和FB2基體參考物質中隨機取樣15個包裝單元，每個包裝單元中取樣2.00 g（最小取樣量為2.00 g），重復取樣3次，采用UPLC-MS/MS法平行測定3次，測定結果采用方差分析法（經F檢驗），統計檢驗參考物質的均勻性。

1.5 穩定性監測

根據JJG 1006-1994和JJF 1343-2012的要求，將樣品置于4 ℃恒溫箱中保存，模擬運輸條件以考察參考物質的短期穩定性。分別在第0、2、4、6、8天進行短期穩定性監測，每次抽取3個包裝單元，每個包裝平行測3次。

參考物質長期穩定性考察按照先密后疏的原則，在第0、1、3、6、12個月進行-20 ℃儲存條件下長期穩定性考察。

1.6 參考物質的定值和不確定度評估

參考物質的定值采用多家實驗室聯合定值、數據匯總統計的方式。參加聯合定值的6家實驗室均具有相應的檢測資質，并具有FB1和FB2標準物質定值的條件，各家實驗室在分析過程中進行嚴格的質量控制，采用UPLC-MS/MS法對制備的參考物質進行定值。對6家實驗室提供的數據，用狄克遜（Dixon）法檢驗實驗室間數據是否有離群值，隨后采用科克倫（Cochran）法檢驗數據的精度為等精度后，最后計算出總平均值和標準偏差。

玉米粉中FB1和FB2基體參考物質的不確定度主要由參考物質的不均勻引入的不確定度（ubb）、參考物質的不穩定引入的不確定度（usts）、參考物質定值引入的不確定度（uA）三部分組成。

2 結果與分析

2.1 均勻性檢驗

采用單因素方差分析法進行組內和組間均勻性檢驗。由表2可知，F＜F0.05（14,30），表明玉米粉中FB1和FB2基體參考物質均勻性良好，符合標準物質技術規范要求。

表2 玉米粉中FB1和FB2基體參考物質的均勻性

2.2 穩定性檢測

2.2.1 短期穩定性考察

由表3可知，經直線擬合法對短期穩定性監測數據進行檢驗，可見｜b1｜

2.2.2 長期穩定性考察

由表4可知，經直線擬合法對長期穩定性監測數據進行檢驗，可見｜b1｜

2.3 定 值

6家實驗室的玉米粉中FB1和FB2基體參考物質定值結果見表5。將所有實驗室的數據匯總分析，每個實驗室的組內數據經狄克遜準則檢驗是否有異常值，各實驗室的定值數據采用科克倫準則判斷數據是否等精度，最終6家實驗室的數據均被采用。因此，本參考物質的定值結果為6家實驗室測定結果的總平均值，即FB1的含量為1.07 mg/kg，FB2的含量為0.43 mg/kg。

表3 玉米粉中FB1和FB2基體參考物質的短期穩定性檢測結果

表4 玉米粉中FB1和FB2基體參考物質的長期穩定性檢測結果

2.4 不確定度評估

2.4.1 均勻性引入的不確定度

FB1均勻性引入的不確定度：

FB2均勻性引入的不確定度：ubb=0.008 2 mg/kg。

2.4.2 穩定性引入的不確定度

FB1短期穩定性引入的不確定度：usts=s(b1)·t=0.003 9×8=0.031 2 mg/kg。

FB1長期穩定性引入的不確定度：ults=0.0271mg/kg。

FB2短期穩定性引入的不確定度：usts=0.0230mg/kg。

FB2長期穩定性引入的不確定度：ults=0.0235mg/kg。

表5 玉米粉中FB1和FB2基體參考物質定值結果 （單位：mg/kg）

2.4.3 定值引入的不確定度

本參考物質的定值采用6家實驗室聯合定值的方法，經狄克遜和科克倫檢驗，6家實驗室的平均值為合作定值結果，將這6組實驗室的平均值作為一組新的數據，計算定值引入的不確定度。

FB1定值引入的不確定度：

FB2定值引入的不確定度：

2.4.4 合成標準不確定度

FB1的合成標準不確定度：

FB2的合成標準不確定度：

2.4.5 擴展不確定度

FB1的擴展標準不確定度：U=k·uCRM=2×0.043 0≈0.09 mg/kg (k=2)。

FB2的擴展標準不確定度：U=k·uCRM=2×0.034 3≈0.07 mg/kg (k=2)。

2.5 定值結果

玉米粉中伏馬毒素B1和B2基體參考物質中FB1的含量為1.07 ±0.09 mg/kg，FB2的含量為0.43±0.07 mg/kg。

3 結 論

本研究通過將產毒菌株接種于玉米培養基，在最佳條件下培養，從而得到含大量FB1和FB2的基質樣本，將其打碎成粉末并過篩，與空白玉米粉等比例稀釋搖勻，獲得了玉米粉中FB1和FB2基體參考物質。組織6家實驗室利用UPLC-MS/MS法進行了聯合定值，考察了其均勻性和穩定性，并對研制過程中產生的不確定度進行了系統評估。結果表明，該基體參考物質均勻性良好，且滿足12個月以上的穩定性要求，最終得到玉米粉中FB1和FB2基體參考物質的量值分別為1.07±0.09 mg/kg和0.43±0.07 mg/kg。因此，該參考物質可用于玉米粉中FB1和FB2的定性和定量檢測、FB1和FB2檢測方法的評價及其代謝毒理學研究等。本研究為國家農產品質量安全風險評估與監測溯源體系的建立，提供了一定的技術支持與物質保障。