沙門氏菌污染豆腐干和牛肉干后代謝物的研究

胡 蝶， 胡 昊， 楊本芹， 潘學軍

（昆明理工大學 環境科學與工程學院，云南 昆明650500）

豆腐干和牛肉干均是即食性食品，營養豐富，在制作、運輸及儲存過程中都有被致病菌污染的風險[1-7]，評估此類即食食品的污染現狀十分重要。

目前的研究多數局限于已發生沙門氏菌病的病情調查和檢測可能被污染致病菌的食品中微生物的存在，但關于沙門氏菌污染食品后的代謝物的研究還較少。作者選取豆腐干和牛肉干作為沙門氏菌的接種培養基，并用氣相色譜-質譜法（Gas Chromatography-Mass Spectrometer，GC-MS）鑒定沙門氏菌污染豆腐干和牛肉干后的代謝物。因GC-MS的分辨率好，靈敏度高，數據庫較為健全，近年來被廣泛使用[8-9]。作者基于GC-MS檢測技術的代謝組學分析平臺研究沙門氏菌分別在污染豆腐干和牛肉干后的特征性和差異性代謝產物[10]，以期能夠為沙門氏菌的典型代謝物的篩選提供參考，并為篩選沙門氏菌污染食品后的潛在生物標志物提供理論和實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沙門氏菌（ATCC14028S）：購自中國普通微生物保藏管理中心；營養肉湯培養基：購自百思生物公司；豆腐干和牛肉干：市售；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）：美國西格瑪公司產品；二氯甲烷（色譜純）、2，4，6-三甲基吡啶：邁瑞達公司產品。

1.2 沙門氏菌的培養

選取沙門氏菌作為研究用菌株。首先將購買的菌株在37℃下水浴解凍，轉移1 mL沙門氏菌菌液至200 mL NB培養基置于37℃培養箱溫育24 h進行增菌[11]。增菌后觀察菌落形態、是否有雜菌，若無雜菌即可保藏以進行后續培養實驗。

豆腐干和牛肉干均與超純水按1 g∶10 mL的比例混合，然后攪拌10 min，18目篩網重復過濾，使豆腐干和牛肉干顆粒直徑小于1 mm，確保制成的培養基足夠均勻，121℃，103 kPa滅菌30 min待用。取20 mL配好的NB培養基、豆腐干培養基（DB）、牛肉干培養基（BJB）分別測定pH值[12]和總有機碳。

將-80℃保藏的菌種復蘇后取1 mL菌液分別加入到200 mL NB、DB、BJB中，在37℃培養箱內培養12 h。取部分菌液在營養瓊脂培養基在37℃下培養48 h后進行計數[13]，另外取10 mL菌液用于代謝組學分析。每組實驗以空白培養基為對照，分別做6個平行。

1.3 基因組測序

首先對沙門氏菌的基因組進行片段化，構建基因組文庫，然后對單鏈DNA片段進行擴增，激光掃描后讀取核苷酸種類，重復讀取，獲得模板DNA片段的序列。利用Illumina Hiseq平臺對沙門氏菌的基因進行測序，然后對原始數據進行質控，統計和基因組評估，完成denovo組裝，隨后可對測序數據進行基因功能預測。

1.4 GC-MS鑒定代謝物

1.4.1 代謝物的提取 取10 mL菌液于50 mL離心管中，迅速加入體積分數為60%的10 mL冷甲醇溶液（-40℃）后渦旋30 s并超聲處理2 h，置于-80℃冰箱中冷凍12 h放入冷凍干燥機冷凍干燥。冷凍干燥后的樣品加入10 mL乙腈、甲醇和超純水（體積比為2∶2∶1）萃取劑，振蕩后將混合液倒入帶有3種規格玻璃球的試管分散機（UTTD）中破碎10 min。將破碎后的樣品置于37℃培養箱中反應2 h，將混合液在-4℃、10 000g的條件下離心15 min，取上清液，真空冷凍干燥。將冷干樣品加入2 mL二氯甲烷，混勻，加入50μL 2，4，6-三甲基吡啶作為內標，進行GC-MS測定。

1.4.2 GC-MS操作條件GC-MS使用DB-624毛細管色譜柱；柱溫升溫程序為初始溫度40℃保持6 min，10℃/min升溫至230℃，保持10 min。載氣為高純氦氣；載氣流量為2.0 mL/min。進樣口溫度230℃，進樣量1.0μL，采用不分流模式。質譜條件：離子源溫度230℃；質譜接口溫度230℃；全掃描模式，質量掃描范圍29～350。

1.5 數據處理

通過美吉生物云平臺（www.majorbio.com）利用基因組序列信息對基因功能進行預測，并找到相關代謝酶的信息。代謝物質譜數據的處理采用Agilent MSD Productivity Chem Station（Agilent Technologies Inc.USA）聯合NIST 2014質譜數據庫進行原始峰提取、數據基線過濾、基線標準、峰對齊、峰識別和峰面積集成，相似度＞70%的物質被認為是可信物質。識別出的代謝物利用SIMCA14.1軟件包進行主成分分析 （Principal components analysis，PCA）和正交偏最小二乘判別（Orthogonal Partial Least Squares Discrimination Analysis，OPLSDA）分析，將OPLS-DA模型中的預測值（VIP＞1）中第一個主成分和單因素方差分析（P＜0.05）相結合，鑒定出主要差異代謝物[14]，比較得出的差異代謝物在KEGG數據庫搜索代謝物途徑，研究不同食品被沙門氏菌污染后主要的代謝通路和潛在生物標志物[15]。使用Origin9.0軟件作圖。

2 結果與討論

2.1 營養肉湯培養基、豆腐干培養基、牛肉干培養基的相關參數

NB、DB、BJB的pH值，TOC值如表1所示。3組培養基的pH分別屬微酸微堿性，張旭東等[16]表明pH值在5～7時，沙門氏菌均能正常生長。3組培養基的TOC值說明3組培養基提供的碳源相差不大，對沙門氏菌的生長不會有很大影響。按國標法測得3組培養基培養12 h后的最大菌落數。菌落數都能達到2.29×108CFU/mL，說明沙門氏菌的生長都是正常的，并未因其他理化性質不同明顯影響沙門氏菌的生長狀況。

表1 培養基的相關參數Table 1 Parameters of medium

2.2 代謝譜圖

沙門氏菌污染食品后會充分利用營養物質進行生長，同時會代謝出多種代謝物，因此對沙門氏菌接種3個培養基12 h后的代謝物進行檢測發現有491個有效峰，經過原始峰提取、數據基線過濾、基線標準、峰對齊、峰識別和峰面積集成，且相似度＞70%的峰有298個。如圖1所示，將TIC色譜圖疊放，可以直接反映每組代謝物的差異。

如圖1（a），沙門氏菌接種于NB之后，相對于未接種沙門氏菌的NB、1-丁醇、均三甲苯可能是差異性代謝產物；如圖1（b），沙門氏菌接種于豆腐干培養基（DS）之后，相對于空白豆腐干培養基（DB），甘油可能是差異性代謝產物；如圖1（c），沙門氏菌接種于牛肉干培養基（BJS）之后，相對于空白牛肉干培養基（BJB），乙醇、甘油、2，4-二叔丁基苯酚可能是差異性代謝產物，作者將結合PCA和OPLSDA進行詳細分析。

圖1 典型GC-MS TIC疊放圖Fig.1 Typical GC-MS TIC stacking map

2.3 沙門氏菌的特征性代謝產物

如圖2所示，可以看出3組空白培養基和接種沙門氏菌的培養基的物質數量和總豐度。因NB、DB和BJB的營養成分有一定的差異[17-19]，因此接種沙門氏菌后降解產生的代謝產物必然有一定差異。結果如下：NB有125種物質檢出，接種沙門氏菌的NB（SM）的代謝物有174種代謝物；DB檢出159種物質，接種沙門氏菌的DB（DS）檢出159種代謝物；BJB檢出270種物質，接種沙門氏菌的BJB（BJS）檢出84種代謝物。

圖2 3組空白培養基和接種沙門氏菌的培養基鑒定的物質總量和總豐度Fig.2 Comparation of the total number and abundance of metabolites in three media with inoculated and without inoculation of S.typhimurium

圖3 分別對3組未接種和接種沙門氏菌的培養基檢測出的代謝物進行了OPLS-DA分析，以增強我們對沙門氏菌在不同培養基中產生的代謝物的了解。得分圖中的所有樣本都在95%的HotellingT平方橢圓內，并且在組間發現了明顯的分離和區別。這些發現表明，OPLS-DA模型可用于識別本實驗的代謝產物成對組之間的差異[20]。

如表2所示3組特征性代謝產物，即對未接種沙門氏菌的3組培養基的物質和接種沙門氏菌的培養基培養12 h后測出來的代謝物進行OPLS分析，VIP＞1和P＜0.05的物質即豐度差異顯著的物質。SM的特征代謝物有20種，DS的特征代謝物有12種，BJS的特征代謝物有7種，這些代謝物主要是烷烴及部分小分子代謝物，如：乙醇、乙酸、甘油、丙二醇、1-丁醇等。表明沙門氏菌都顯著降解了3個培養基中的物質且特征性代謝產物有所區別。

首先，沙門氏菌接種NB，DB，BJB產生的特征性代謝產物都包含大量的烷烴和芳香族物質。由KEGG知烷烴主要參與脂肪酸降解，角質、絲氨酸和蠟生物合成和次級代謝產物的生物合成三大代謝途徑，Piao表明烷烴是牛肉中脂質氧化形成的主要揮發性化合物[21]，且革蘭氏陰性菌都有將醛類物質降解為烷烴的能力[22]，因此3組培養基的特征性代謝產物都含有烷烴（表2）。而芳香族物質的存在應該是NB培養基的大分子芳香族物質被降解。

其次，1-丁醇同時是3個培養基被沙門氏菌接種后的特征性代謝產物，因此1-丁醇有可能成為沙門氏菌降解的典型代謝物。另外，豆腐干和牛肉干接種沙門氏菌后的特征性代謝產物還有甘油，甘油是一種常見的細胞代謝產物，存在于各種生物體中[23]，豆腐干和牛肉干的特征性代謝產物中同時含有甘油，可能是因為兩者制作過程中加入脂肪，被沙門氏菌大量降解為短鏈脂肪酸及甘油。

圖3 OPLS-DA得分圖Fig.3 OPLS-DA score plot

表2 NB、DB、BJB中的特征性代謝產物Table 2 Characteristic metabolites of NB and SM，BD and BS，BJB and BJS

乙酸、乙醇等小分子大多都是生物進行基本生命活動的產物，因此每組培養基的特征性代謝產物還有一些特殊的小分子醇酸酮。NB培養基中的乙酸、丙酸；豆腐干培養基的丙二醇、乙酰胺、3-甲基-2-丁酮、棕櫚酸甲酯、麥芽酚；牛肉干中的乙醇及兩種酮類可能是沙門氏菌降解牛肉干的特征性代謝物。

2.4 沙門氏菌的差異性代謝產物

有機體攝入外源物質或發生病變時，對機體穩態產生干擾，反映其基因或蛋白質轉錄發生的變化，代謝產物的種類或數量發生變化即為差異性代謝產物。因NB培養基有充足的碳源和氮源，且理化性質適合多數菌株，因此將接種于NB培養基的沙門氏菌降解產物看作是對照，即差異性代謝產物在具體指將SM和DS、SM和BJS的代謝物分別進行OPLS分析，其VIP＞1，P＜0.05即認定為差異性代謝產物。SM、DS、BJS的代謝物PCA分析如圖4（a）所示，沙門氏菌在3組培養基能顯著分開，說明沙門氏菌污染不同食品產生的代謝產物是有差異的。SM與DS和BJS的OPLS-DA分析分別如圖4（b），圖4（c），可以看到，兩兩培養基的代謝物有明顯差異。進一步的S-plot分析可得出差異性代謝產物。

圖4 PCA和OPLS-DA得分圖Fig.4 PCA and OPLS-DA score plot

如表3所示，SM和DS的差異性代謝產物有31種，SM和BJS的差異性代謝物有32種，且差異性代謝產物種類和上述沙門氏菌的特征性代謝產物（表2）類似，有大量的烷烴和芳香類化合物。除上述兩類物質外，SM和DS的差異性代謝物有醋酸、異佛爾酮、1-丁醇，SM和BJS的差異性代謝物有丙酸、1-丁醇、乙酰胺、吡咯并[1，2-a]吡嗪-1，4-六氫-二酮、2-吡咯烷酮、乙醇、二氫-2，4（1H，3H）-嘧啶二酮。從表中可以看出不同食品的差異性代謝產物都有1-丁醇和2，4-二叔丁基苯酚。

2.5 沙門氏菌的代謝系統分析

沙門氏菌的全基因組序列全長4 864 529 bp，共包含5 048個基因。隨后對得到的編碼基因進行功能KEGG注釋，如圖4。沙門氏菌的基因中代謝（metabolism）相關的基因有1 924個，環境信息處理（Environmental Information Processing）相關的基因有456個，基 因 信 息 處 理 （Genetic Information Processing）相關的基因有231個，細胞過程（Cellular Processes）相 關 的 基 因 有225個。可 見，代 謝（metabolism）相關的基因占比最大，其中又以碳水化合物的代謝（Carbohydrate metabolism）和全局和概覽圖（Global and overview maps）的基因居多，分別有497和303個基因。

表3 沙門氏菌在不同培養基的差異性代謝產物Table 3 Differential metabolites in different medium with S.typhimurium

將SM和DS的差異性代謝產物進行代謝通路分析（www.metaboanalyst.ca），表明主要參與丙酮酸代 謝 （Pyruvate metabolism） 和 糖 酵 解/糖 異 生（Glycolysis/Gluconeogenesis），而基因信息表明參與這兩條代謝路徑的關鍵酶分別有50和40條，都包含在碳水化合物的代謝里。將SM和BJS的差異性代謝產物進行代謝通路分析，表明主要參與丙酸鹽代謝（Propanoate metabolism）和糖酵解/糖異生，而基因信息表明參與這兩條代謝路徑的關鍵酶分別有40和50條，都包含在碳水化合物的代謝中。

圖5 沙門氏菌基因組的KEGG注釋Fig.5 KEGG annotation of S.typhimurium genome

3 結語

綜上所述，1-丁醇和2，4-二叔丁基苯酚同時是沙門氏菌接種于豆腐干和牛肉干培養12 h后的差異性代謝產物。首先，KEGG數據庫（http：//www.kegg.jp/）并沒有收錄2，4-二叔丁基苯酚相關的代謝信息，只在沙門氏菌的基因信息中發現芳香化合物的降解（Degradation of aromatic compounds）有11個關鍵酶涉及芳香化合物的代謝。其次，KEGG數據庫表明1-丁醇主要參與丁酸代謝（Butanoate metabolism）、不同環境的微生物代謝（Microbial metabolism in diverse environments）及芳香族化合物的降解（Degradation of aromatic compounds）3個代謝路徑，而沙門氏菌的KEGG基因注釋也表明沙門氏菌中有28個丁酸代謝相關基因和11個芳香族化合物的降解的相關基因，見表1和表2。此外，1-丁醇的代謝過程也可能會受到沙門氏菌中CoA酰化醛脫氫酶的影響[24]。有研究表明，微生物Enteromorpha intestinalis[25]和Clostridium acetobutylicum[26]也能產生1-丁醇，因此1-丁醇是沙門氏菌污染豆腐干和牛肉干后的典型代謝物，但能不能作為沙門氏菌的潛在標志物還有待進一步研究。

作者利用GC-MS技術分別在不同的培養基中檢測到了100種左右的代謝產物，有大量的烴類物質和芳香族物質參與反應。沙門氏菌的基因注釋表明碳水化合物的代謝的基因占比更多，且有39個有關1-丁醇的基因，結合沙門氏菌的特征性代謝產物和差異性代謝產物表明1-丁醇是主要的代謝物。因此1-丁醇是沙門氏菌污染食品的典型代謝物，但要確定其是否是潛在生物標志物還需要進一步研究。本研究為篩選沙門氏菌污染食品后的潛在生物標志物提供一定的實驗依據。