磁性三維還原石墨烯的制備及其在電化學免疫檢測牛乳中結核桿菌H37Ra的應用

劉希雅，田春妹，鄭鷺飛，鐘平勝，張馨方，任佳麗,

（1.林產可食資源安全與加工利用湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410004；2.中南林業科技大學食品科學與工程學院，湖南 長沙 410004；3.中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所，北京 100081）

結核病是一種人畜共患病，其病原菌主要為人型結核桿菌和牛結核桿菌，可通過污染乳及乳制品感染人類[1]，成為繼艾滋病后嚴重威脅人類健康的最大殺手，在世界范圍內有爆發之勢[2-4]。世界動物衛生組織將其列為B類動物傳染病，我國將其列為二類動物傳染病。2018年世界衛生組織在《全球結核病報告》中指出，全球結核病新增病例達1 000萬，其中死亡人數約157萬，中國成為世界排名第2的高發病率國家[5]。世界各國每年均花費大量的人力、物力和財力去防制此病的發生。在原料乳收購現場進行檢測可從源頭阻斷結核桿菌的傳播[6]。

目前常用的結核桿菌檢測技術主要包括細菌學、免疫學和分子生物學等[7-9]。世界動物衛生組織指定的檢測方法為結核菌素測試法，此法受生物、化學以及物理等因素的影響，導致結果敏感性和特異性均較低，細菌學方法是目前使用的“金標準”方法，由于結核桿菌增代時間長，生長緩慢，需要2～6 周才能長出顆粒狀或絮狀的菌落[10]，極大延長了檢測時間（一般需要4～8 周），等結果出來，疫情已經發生。對于原料收購環節和出入境檢驗檢疫，乳及其制品中結核桿菌的現場快速檢測方法顯得尤為重要。因此，研制準確、靈敏、快速而且價格便宜的便攜式方法迫在眉睫[11-13]。

電化學傳感器具有靈敏度高、檢測速度快、檢測成本低且檢測裝置可微縮化等優點，為研制便攜式現場檢測設備奠定了基礎[14-15]。電化學電極在微縮化的同時降低了檢測能耗，但也降低了電子傳輸速率。石墨烯作為一種新興材料，憑借其超高的比表面積、良好的機械性能和電化學性質[16-17]，在化學修飾電極方面得到了廣泛的應用[18-21]。而三維結構石墨烯材料不僅可降低電極阻抗，同時還彌補了電極微縮引起的比表面積下降的缺點，提高電子傳輸效率[22-24]。本研究制備了磁性三維還原石墨烯復合材料，對不同修飾材料進行了表征和電化學性能探究，并在此基礎上建立了一種快速、靈敏、特異的乳品中結核桿菌H37Ra的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

結核桿菌（Mycobacterium tuberculosisH37Ra）、大腸埃希氏菌（Escherichia coliATCC 25922）、腸炎沙門氏菌（Salmonella enteritidisATCC 14028）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureusATCC 25923） 湖南省胸科醫院；石墨烯（graphene，G） 成都有機化學有限公司；牛血清蛋白 北京索萊寶生物技術有限公司；結核桿菌多克隆抗體 上海滬崢生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

CHI920D電化學工作站、玻碳電極、甘汞電極、鉑絲電極 上海辰華儀器有限公司；Sigma HD掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM） 德國Zeiss公司；Finder One微區激光拉曼光譜儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；DHP-500電熱恒溫培養箱 北京市永光明醫療儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 結核桿菌H37Ra母液制備

在無菌條件下，用接種環挑取結核桿菌于裝有吐溫/生理鹽水緩沖液的痰瓶中，在渦旋振蕩儀上振蕩打散5 min，制成菌懸液。吸取1～2 mL菌懸液加入蘇通液體培養基中，于37 ℃恒溫搖床中培養1～2 周得到母液，母液通過麥氏比濁法調節至1×108CFU/mL。

1.3.2 磁性復合材料的制備

采用Hummers法制備氧化石墨烯（graphene oxide，GO）。稱取3.2 g FeCl3·6H2O加入到40 mL去離子水中，再稱取5.9 g C6H5Na3O7·2H2O加入到60 mL去離子水中。將配好的溶液在磁力攪拌下緩慢加入到已經超聲分散2 h的氧化石墨烯中。然后，將6.0 mL的80%偏二甲肼溶液滴加到該溶液中，繼續攪拌30 min。將混合物分裝轉移至50 mL內壁涂了聚四氯乙烯的高壓反應釜中，在180 ℃高溫恒溫箱中反應12 h，待冷卻后，冷凍干燥24 h，即可獲得四氧化三鐵/三維還原氧化石墨烯（ferroferric oxide/three-dimensional reduced graphene oxide，Fe3O4@3D-RGO）復合材料。將復合材料制備過程中的各種中間材料如G、GO和Fe3O4@3D-RGO復合材料進行SEM、光電子能譜（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）以及拉曼光譜表征。

1.3.3 修飾電極的制備與檢測

將裸玻碳電極拋光，晾干備用。分別用25%、35%、45%、55%、65%、75%、85%、95%的乙醇溶液配制修飾液，考察其成膜穩定性，最終確定75%為乙醇溶液最佳體積分數。同時參照文獻[25-26]，采用0.1% Nafion溶液作為修飾玻碳電極的保護膜。用電子分析天平稱取0.005 g Fe3O4@3D-RGO，以75%乙醇溶液和0.1% Nafion溶液為分散相配制5 mg/mL的修飾液。分別取15、20、25、30、35、40、45 μL修飾液滴涂于電極表面，將電極置于45 ℃恒溫箱中干燥后，以修飾的玻碳電極為工作電極、飽和甘汞電極為參比電極以及鉑電極作為對電極構成三電極體系，置于含有0.1 mmol/L鐵氰化鉀的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）（0.01 mol/L，pH 7.4）中進行交流阻抗（electrochemical impedance spectroscopy，EIS）測試，選擇合適的修飾液體積進行后續實驗。所有的測量均在開路狀態下進行，測量頻率為0.1～100 kHz，外加振幅為5 mV的交流擾動電壓。

1.3.4 電化學免疫傳感器的制備與結核桿菌H37Ra的檢測

用移液槍吸取30 μL Fe3O4@3D-RGO修飾液滴涂于玻碳電極表面并在室溫下干燥，再滴涂10 μL 1 mg/mL的結核桿菌抗體，使其覆蓋于玻碳電極表面，于室溫下保存2 h。然后，將電極置于45 ℃恒溫箱中干燥后，在超純水中浸泡5 min，使沒有固定的抗體溶解到水中，用超純水沖洗電極，氮氣吹干，然后用1% BSA進行封閉，用同樣方法清洗電極并干燥，修飾電極制備完成，保存于4 ℃冰箱中備用。檢測時，將三電極體系置于含有不同濃度結核桿菌H37Ra（通過PBS稀釋結核桿菌母液獲得）的0.1 mmol/L鐵氰化鉀的PBS（0.01 mol/L，pH 7.4）中進行EIS測試。

1.3.5 電化學免疫傳感器重復性、穩定性及特異性評估

分別配制不同濃度（104、105、106CFU/mL）的結核桿菌，用Fe3O4@3D-RGO復合修飾材料制備的電化學免疫傳感器進行阻抗測定，每個濃度平行測3 次，評估該免疫傳感器的重復性；將制備的修飾電極保存在4 ℃冰箱中，每天測定105CFU/mL結核桿菌菌液，通過10 次測定的阻抗值評估所制備傳感器的穩定性；采用結核桿菌和一些食品中常見的致病菌（包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌），均制備成約103CFU/mL的菌液，記錄電化學免疫傳感器的阻抗變化，以評估該傳感器的特異性。

1.3.6 電化學免疫傳感器檢測人工污染牛乳中結核桿菌H37Ra

用麥氏比濁法配制不同濃度的結核桿菌菌懸液各10 mL。取100 μL用傳統方法涂布培養，置于37 ℃培養箱中2 周后進行菌落計數，做3 次平行。另取5 mL菌懸液4 000 r/min離心40 min，將得到的菌體分散于5 mL牛乳中，用Fe3O4@3D-RGO復合材料制備的電化學免疫傳感器進行測定。牛乳樣品在混勻器上充分混合后，4 000 r/min離心40 min，棄去上清液，加入5 mL生理鹽水重懸沉淀，使用定性濾紙過濾，濾液經4 000 r/min離心40 min，再棄去上清液，加入5 mL含有0.1 mmol/L鐵氰化鉀的PBS重懸沉淀，混勻待測，每組樣品測3 次，將實驗結果帶入標準曲線計算出結核桿菌濃度，與平板計數實驗結果進行對比，并用SPSS軟件配對樣本t檢驗進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同納米材料的結構表征

圖1 G（A）、GO（B）、Fe3O4@3D-RGO（C）的SM圖Fig. 1 SEM images of graphene (A), GO (B), and Fe3O4@3D-RGO (C)

圖2 G（A）、GO（B）、Fe3O4@3D-RGO（C）的XPS圖Fig. 2 XPS profiles of graphene (A), GO (B), andFe3O4@3D-RGO (C)

圖3 G（A）、GO（B）、Fe3O4@3D-RGO（C）的拉曼光譜圖Fig. 3 Rammam spectra of graphene (A), GO (B), andFe3O4@3D-RGO (C)

圖1 ～3分別顯示了修飾材料在制備過程中的結構特點、化學元素的含量變化以及石墨烯三維結構的變化。由圖1和圖2可以看出，未經修飾的石墨烯為平面單分子薄層結構，含氧量約為14%；經Hummer法制備的GO與石墨烯具有相似的層狀結構，但更厚，這是由于氧化石墨烯表面嫁接了大量的活性基團，如羧基（—COOH）、酯基（—COO－）、羰基（—C＝O）、環氧基[—CH(O)CH-]、羥基（—OH）等所造成的，其含氧量高達36%，約是石墨烯的3 倍，這也從另一方面證明了含氧官能團的存在；用水熱一步還原法制備的Fe3O4@3D-RGO復合材料表面附著了許多直徑約50～300 nm的球狀顆粒，這是在制備過程中Fe3＋與Fe2＋一起附著到還原氧化石墨烯（RGO）表面所形成的Fe3O4納米顆粒，與氧化石墨烯相比，復合材料厚度減小，比表面積增大，使其能夠負載大量Fe3O4納米顆粒。由圖2C可知，RGO表面仍然存在部分—OH、—COOH等含氧基團，使Fe3O4納米顆粒可以通過共價作用結合在RGO表面，同時，這種作用力也阻止了Fe3O4的團聚，從而獲得了穩定的Fe3O4@3D-RGO磁性復合材料。從不同修飾材料的拉曼圖譜（圖3）可以看出石墨烯在514 nm波長的激光激發下產生2 個強特征峰，從這2 個峰的位置及形狀可以大致推出石墨烯的層數，并依次可以推斷所制備的Fe3O4@3D-RGO復合材料具有三維結構；氧化石墨烯具有較厚的堆積片層，這與石墨烯的氧化造成的結構缺陷有關。

2.2 不同納米材料的電化學性能

測定裸玻碳電極（bare glassy carbon electrode，GCE）、氧化石墨烯修飾電極（GO/GCE）及復合材料修飾電極（Fe3O4@3D-RGO/GCE）在1 mmol/L鐵氰化鉀溶液中的交流阻抗譜。

圖4 不同修飾電極的電化學阻抗圖譜Fig. 4 Electrochemical impedance of different modified electrodes

一般情況下，修飾電極阻抗大小與阻抗圖譜半圓直徑呈正比。通過對比圖4中GCE、GO/GCE和Fe3O4@3DRGO/GCE的阻抗圖譜可知，GO/GCE的阻抗遠大于GCE，而Fe3O4@3D-RGO/GCE的阻抗遠小于GCE。這是因為GO表面含有大量的含氧活性基團，它們會阻礙電子傳遞，使阻抗增大。而對于Fe3O4@3D-RGO/GCE，含氧基團不僅能夠增強復合材料的水溶性，減小信噪比，還可以與Fe3O4發生相互作用使修飾材料比表面積增大、導電性增強，阻抗減小。

2.3 修飾液體積對電化學阻抗的影響

為獲得Fe3O4@3D-RGO磁性復合材料的最優阻抗特征，以不同體積的修飾液（質量濃度5 mg/mL）對電極進行修飾，用交流阻抗譜進行表征，獲得Fe3O4@3D-RGO修飾電極的導電性能。

圖5 不同體積三維磁性復合材料修飾電極阻抗譜Fig. 5 Electrochemical impedance of different electrodes modified with different volumes of Fe3O4@3D-RGO

由圖5可知，電極經Fe3O4@3D-RGO磁性復合材料修飾后，阻抗隨修飾液體積的增大顯著減小。但由于修飾液體積為30 μL時即可在玻碳電極表面達到飽和，繼續滴加會造成修飾液浪費，若分2 次滴加，又會使電極表面修飾膜太厚，不利于后期繼續滴涂抗體制備免疫傳感器，故在后續實驗中，使用修飾液均為30 μL。

2.4 Fe3O4@3D-RGO復合材料修飾電極電化學性能

對免疫傳感器制備過程中不同階段的狀態，即GCE、Fe3O4@3D-RGO/GCE、結核桿菌抗體修飾的Fe3O4@3D-RGO/GCE（Fe3O4@3D-RGO/Ab/GCE）以及用BSA封閉后的Fe3O4@3D-RGO/Ab/GCE（Fe3O4@3DRGO/Ab/BSA/GCE）以及結核桿菌吸附后的修飾電極（Fe3O4@3D-RGO/Ab/BSA/H37Ra/GCE）在鐵氰化鉀電解液中的電化學行為進行交流阻抗譜測試，它們的電子傳遞阻抗分別為85.76、34.62、39.31、49.62、115.00 Ω（圖6）。結果表明，Fe3O4@3D-RGO復合材料的修飾增加了電極表面積并加速了電子轉移，使得Fe3O4@3DRGO/GCE的阻抗遠小于GCE。當修飾電極表面覆蓋有結核桿菌抗體時，修飾膜的表面又增加了一層抗體膜，抑制了電子的傳遞，交流阻抗增大。用BSA對電極表面的非特異性部位進行封閉后，電極阻抗進一步增大，上述現象說明生物活性物質極大地阻礙了電子轉移效率。盡管如此，修飾后的電極阻抗仍然小于裸電極，結果證明Fe3O4@3D-RGO復合材料可提高電子的傳輸效率。結核桿菌吸附后，電化學阻抗明顯增大，說明所制備的電化學免疫傳感器可以用來監測抗體與目標菌抗原結合所引起的阻抗變化。

圖6 電化學免疫傳感器檢測結核桿菌37Ra原理Fig. 6 Principle of electrochemical immunosensor for the detection of M. tuberculosis H37Ra

2.5 Fe3O4@3D-RGO復合修飾材料制備的電化學免疫傳感器檢測結核桿菌H37Ra

圖7 為Fe3O4@3D-RGO復合修飾材料制備的電化學免疫傳感器檢測不同濃度結核桿菌H37Ra的交流阻抗圖，其半圓曲線的直徑表示溶液阻抗Z，而橫縱坐標Z’和Z’分別為阻抗Z的實部和虛部。在H37Ra濃度為1×103～1×108CFU/mL的范圍內，電極阻抗與目標檢測物濃度的對數呈現較強的線性關系，回歸方程為y＝19.77lgN－49.14，相關系數為0.982。檢出限為1×102CFU/mL，由D＝3SD/k計算得到，其中SD是空白樣品與檢測阻抗信號的標準偏差，k為標準曲線的斜率（圖8）。

將Fe3O4@3D-RGO復合修飾材料制備的電化學免疫傳感器與其他相關方法[27-30]進行比較，其結果如表1所示。本實驗基于Fe3O4@3D-RGO復合材料的免疫電化學方法檢測結核桿菌H37Ra的線性范圍寬，檢出限略低，檢測時間更快速，且不需任何昂貴的儀器設備，操作簡單、無需樣品前增菌和預富集。制備的電化學免疫傳感器的優良性能可歸因于多種因素：首先，Fe3O4@3D-RGO磁性復合材料促進了電極表面電子傳輸，提高了電化學性能。此外，水熱一步還原法制備的Fe3O4@3D-RGO磁性復合材料克服了石墨烯片層之間脫離溶劑后容易產生p-π堆疊而導致比表面積降低的缺陷，獲得更大的比表面積，使得所研制的電化學免疫傳感器具有較低的檢出限。

圖7 電化學免疫傳感器用于不同濃度結核桿菌37Ra的檢測Fig. 7 Detection of different concentrations of M. tuberculosis H37Ra using electrochemical immunosensor

圖8 修飾電極阻抗變化量與結核桿菌37Ra濃度對數關系圖Fig. 8 Relationship between impedance change and logarithmic concentration of M. tuberculosis H37Ra

表1 電化學免疫傳感器與其他方法比較Table 1 Comparison of the proposed electrochemical immunosensor with other methods

2.6 Fe3O4@3D-RGO復合修飾材料制備的電化學免疫傳感器重復性、穩定性和特異性探究

傳感器的穩定性、重復性和特異性是衡量其能否在實際檢測中應用的關鍵指標。如表2所示，3 組菌液的相對標準偏差均小于5%，顯示了較高的精密度，表明Fe3O4@3D-RGO復合修飾材料制備的電化學免疫傳感器具有較好的重復性。電化學免疫傳感器穩定性測試阻抗圖譜見表3，當其阻抗響應值相對標準偏差小于5%，表明修飾電極具有較好的穩定性[31]。為了進一步測試免疫傳感器的特異性，用大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌等非目標菌進行對照實驗，結果如圖9所示，結核桿菌引起的阻抗變化約為非目標菌的8 倍，說明該免疫傳感器的特異性較好。

表2 電化學免疫傳感器的重復性測試結果Table 2 Repeatability evaluation of the electrochemical immunosensor

表3 電化學免疫傳感器的穩定性測試結果Table 3 Stability evaluation of the electrochemical immunosensor

圖9 電化學免疫傳感器特異性分析Fig. 9 Specificity analysis of the electrochemical immunosensor

2.7 人工污染牛乳樣品檢測結果

將所制備的電化學免疫傳感器用于人工污染牛乳樣品檢測，其結果與傳統培養計數法進行對比，并用SPSS軟件進行顯著性分析（表4）。結果表明，電化學免疫傳感器檢測法與傳統培養計數法結果一致（P=0.270＞0.05），電化學免疫傳感器法相對標準偏差為6.53%～8.19%，回收率在107%～118%之間。

表4 人工污染牛乳樣品中結核桿菌37Ra的檢測（n=3）Table 4 Detection of M. tuberculosis 37Ra in artificially contaminated milk (n= 3)

表4 人工污染牛乳樣品中結核桿菌37Ra的檢測（n=3）Table 4 Detection of M. tuberculosis 37Ra in artificially contaminated milk (n= 3)

樣品號 傳統培養計數法/（CFU/mL）電化學免疫傳感法/（CFU/mL） RSD/% 回收率/%1 4.4×103 4.9×103 8.19 111 2 4.4×104 5.2×104 7.02 118 3 4.4×105 5.1×105 6.53 115 4 4.4×106 4.7×106 8.51 107

3 結 論

本實驗采用水熱一步還原法制備了Fe3O4@3D-RGO復合材料，利用75%的乙醇溶液和0.1% Nafion溶液作為分散體系，簡便、高效地制備了電化學免疫修飾電極，并將其應用于牛乳中結核桿菌H37Ra的快速定量檢測。所制備的電化學免疫傳感器線性范圍寬、靈敏度高、穩定性和重復性良好、在15 min內即可得到結果，與傳統檢測方法（2～8 周）相比，有效縮短了檢測時間，為便攜式傳感器的構建及乳品中結核桿菌的現場快速檢測提供了技術支撐。