大黃酸納米混懸劑的制備及其體內藥動學研究

張亞林，喻海洋，黃 濤*

（1.黃河科技學院，河南鄭州 450005；2.河南省人民醫院，河南鄭州 450011）

近年來,大黃臨床應用范圍正在逐漸擴大［1-2］,其主要活性成分為大黃酸,具有抗炎、降血脂、降血壓、保肝、抗腫瘤等藥理活性［3-4］,研發價值較大,但該成分在37 ℃時的溶解度僅為3.89 μg/mL［5］,生物利用度也僅為16.4%［6］。

納米混懸劑是將難溶性藥物與穩定劑通過不同制劑技術制得的一種 “純” 藥物膠態分散體系［7-9］,其載藥量大,制備工藝簡單,可促進藥物快速溶出,提高其口服吸收生物利用度,丹曲林（商品名Ryanodex,英國Norgine公司）、茶堿（商品名Theodir,日本Mitsubishi Tanabe Pharma公司）等上市產品均采用了該技術。本實驗制備了大黃酸納米混懸劑,并考察其體內藥動學,以期為其他相關制劑的開發提供參考。

1 材料

AR2140型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；Agilent 1260型高效液相色譜儀 （美國Agilent公司）；ATS型均質機（加拿大Seeker公司）；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鄭州長城科工貿有限公司）；Master-sizer型粒度分析儀（英國馬爾文儀器有限公司）；VORTEX-5型渦旋混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；AP-40-110LA型超低溫冰箱（浙江愛普生儀器有限公司）；TYH-2型氮氣吹掃儀（廣西大學附屬科學儀器有限公司）。

大黃酸原料藥（批號H160515,純度98.0%,陜西森弗生物技術有限公司）；大黃酸對照品（批號110757-201504,純度98.6%,中國食品藥品檢定研究院）；大豆卵磷脂（批號AL-PC-98T,輔必成上海醫藥科技有限公司）；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na,批號A1706-32,上海長光企業發展有限公司）；聚乙烯吡咯烷酮K30 （PVP K30,批號25000240379,亞什蘭集團公司）；肝素鈉（批號20160511S,新泰市朝陽生化研究所）。

清潔級SD大鼠,體質量（300±20）g,購自河南省動物實驗中心,動物生產許可證號SCXK（豫）2016-0001。

2 方法與結果

2.1 大黃酸含有量測定（HPLC法）

2.1.1 色譜條件 Agilent Plus C18色譜柱（4.6 mm×150 mm,5 μm）；流動相0.2% 磷酸-甲醇（35 ∶65）；體積流量1.0 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波長254 nm。

2.1.2 線性關系考察 精密稱取10.14 mg大黃酸對照品,溶于10 mL甲醇中,得到1.014 mg/mL貯備液,流動相依次稀釋至507、253.5、101.4、50.7、5.07 μg/mL,作為對照品溶液,在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定。以溶液質量濃度為橫坐標（X）,峰面積為縱坐標（Y）進行回歸,得方程為Y=0.501 1X-5.322 1 （r=1.000 0）,在5.07～507 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.1.3 方法學考察 取1.0 mL大黃酸納米混懸液至10 mL量瓶中,甲醇超聲溶解后定容,作為供試品溶液,于4、8、12、24、48 h在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定,測得大黃酸峰面積RSD為0.57%,表明溶液在48 h內穩定性良好。取“2.1.2” 項下5.07、253.5、507 μg/mL對照品溶液,在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定,測得大黃酸日內精密度RSD小于0.63%,日間精密度RSD小于1.03%,表明該方法精密度良好。取不含大黃酸的空白納米混懸劑適量,甲醇依次稀釋至50、100、150 μg/mL,測得大黃酸加樣回收率為99.36%～100.07%,RSD小于1.54%。

2.2 大黃酸納米混懸劑制備 取大黃酸50 mg、大豆卵磷脂25 mg,加入30 mL丙酮,45 ℃下磁力攪拌3 h至溶液澄清,減壓濃縮至約5 mL,作為有機相,冷卻至室溫；取適量PVP K30,加到50 mL蒸餾水中溶解,作為水相,在轉速1 000 r/min、一定制備溫度下將有機相緩慢滴加到水相中,45 ℃下減壓濃縮20 min以除去丙酮,在一定均質壓力下循環均質一定次數,補加蒸餾水至50 mL,即得。

2.3 單因素試驗

2.3.1 PVP K30用量 固定制備溫度15 ℃,均質壓力80 MPa,均質次數10次,考察PVP K30用量25、50、75、100 mg對粒徑的影響,結果見圖1。由此可知,PVP K30用量為75 mg時粒徑最小。

2.3.2 制備溫度 固定PVP K30用量75 mg,均質壓力80 MPa,均質次數10次,考察制備溫度0、15、30、45 ℃對粒徑的影響,結果見圖2。由此可知,制備溫度為0 ℃時粒徑最小。

2.3.3 均質壓力 固定PVP K30用量75 mg,制備溫度0 ℃,均質次數10次,考察均質壓力60、80、100、120 MPa對粒徑的影響,結果見圖3。由此可知,均質壓力為100 MPa時粒徑最小。

圖1 PVP K30用量對粒徑的影響Fig.1 Effect of PVP K30 consumption on particle size

圖2 制備溫度對粒徑的影響Fig.2 Effect of preparation temperature on particle size

圖3 均質壓力對粒徑的影響Fig.3 Effect of homogenization pressure on particle size

2.3.4 均質次數 固定PVP K30用量75 mg,制備溫度0 ℃,均質壓力100 MPa,考察均質次數8、10、12、15、20次對粒徑的影響,結果見圖4。由此可知,均質次數15次時粒徑最小。

圖4 均質次數對粒徑的影響Fig.4 Effect of homogenization frequency on particle size

2.4 正交試驗 在單因素試驗基礎上,以PVP K30用量（A）、均質壓力（B）、均質次數（C）為影響因素,粒徑（Y）為評價指標,正交試驗優化制備工藝,因素水平見表1,結果見表2,方差分析見表3。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

表2 試驗設計與結果Tab.2 Design and results of tests

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

由表2可知,粒徑最小的最優工藝為A2B2C2；由表3可知,因素C具有顯著影響（P＜0.05）,而B無顯著影響（P＞0.05）。最終確定,大黃酸納米混懸劑制備方法為取大黃酸50 mg、大豆卵磷脂25 mg,加入30 mL丙酮,45 ℃下磁力攪拌3 h至溶液澄清,減壓濃縮至約5 mL,作為有機相,冷卻至室溫；取75 mg PVP K30,加入50 mL蒸餾水中溶解,作為水相,在轉速1 000 r/min、制備溫度0 ℃下將有機相緩慢滴加到水相中,45 ℃下減壓濃縮20 min以除去丙酮,在均質壓力100 MPa下循環均質15次,補加蒸餾水至50 mL,即得。按上述優化工藝進行3批驗證試驗,測得平均粒徑為（170.86±3.07）nm,表明該方法穩定可靠。

2.5 大黃酸納米混懸劑表征

2.5.1 載藥量 精密量取5 mL納米混懸劑,不加凍干保護劑進行冷凍干燥,稱定質量M1,加入100 mL甲醇溶解,10 000 r/min離心15 min,0.45 μm微孔濾膜過濾,取續濾液,在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定,計算質量M2,平行3次,計算載藥量,公式為載藥量= M2/M1×100%。結果,載藥量為（32.14±0.92）%。

2.5.2 粒徑、Zeta電位 按優化工藝平行制備3批大黃酸納米混懸劑,各取0.1 mL,蒸餾水稀釋50倍后測定粒徑、Zeta電位,結果見圖5～6。由此可知,納米混懸劑平均粒徑為（170.86±3.07）nm,Zeta電位為 （-31.90±1.34）mV,PDI為0.124±0.016。

圖5 納米粒粒徑分布Fig.5 Particle size distribution of nanoparticles

圖6 納米粒Zeta電位Fig.6 Zeta potential of nanoparticles

2.5.3 形態 取大黃酸納米混懸劑適量,稀釋50倍后滴于銅網上,濾紙吸去水分后自然晾干,置于透射電鏡（TEM）選定區域中拍照,結果見圖7。由此可知,納米混懸劑中納米粒呈球形,分布均勻,粒子之間無粘連。

圖7 納米混懸劑TEM圖Fig.7 TEM image for nanosuspensions

2.5.4 體外釋藥 取大黃酸納米混懸液4 mL,加入5%甘露醇,在-60 ℃超低溫冰箱中預凍48 h后取出,迅速置于-25 ℃冷凍干燥機中處理12 h,再于6 h內緩慢升溫至25 ℃,保持3 h后取出,即得凍干粉。取大黃酸及其納米混懸液凍干粉（以大黃酸計10 mg）適量,加入2 mL超聲脫氣水制備混懸液,轉移至活化透析袋中,兩端扎緊,設定溶出儀溫度為（37±1）℃,轉速為100 r/min,溶出介質為900 mL超聲脫氣水,于不同時間點各取樣3.0 mL,并保持溶出介質體積不變,0.45 μm微孔濾膜過濾,在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定,繪制體外釋藥曲線,見圖8。由此可知,納米混懸劑40 min內累積溶出度為95.73%,但原料藥90 min內僅為16.13%。

圖8 大黃酸體外釋藥曲線Fig.8 In vitrodrug release curves for rhein

2.6 藥動學研究

2.6.1 分組、給藥及采血 12只大鼠隨機分為2組,每組6只,給藥前空腹12 h,灌胃給予大黃酸及其納米混懸劑凍干粉的0.5% CMC-Na混懸液（25.0 mg/mL）,給藥劑量均為50 mg/kg （以大黃酸計）,于0.083、0.167、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 h眼眶靜脈叢取血各約0.3 mL,置于肝素化離心管中（在6 h內補充適量生理鹽水以防止生理性缺血）,2 500 r/min離心2 min,置于-20 ℃冰箱中。

2.6.2 血漿樣品處理 參考文獻［4］報道的方法。血漿樣品在室溫下解凍后精密吸取100 μL至離心管中,加入1.5 mL甲醇渦旋5 min后12 000 r/min離心5 min,取上清液,40 ℃下緩慢吹干,100 μL甲醇復溶。

2.6.3 線性關系、專屬性考察 取“2.1.2” 項下貯備液適量,甲醇依次稀釋至12.68、6.34、3.17、1.585、0.317 μg/mL,各精密量取0.4 mL,45 ℃氮氣緩慢吹去有機溶劑后加入0.4 mL空白血漿,作為血漿對照品溶液,各精密吸取100 μL,按“2.6.2” 項下方法處理后在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定。以溶液質量濃度為橫坐標（X）,峰面積為縱坐標（Y）進行回歸,得方程為Y=2.523 7X-2.208 4 （r=0.991 3）,在0.317～12.68 μg/mL范圍內線性關系良好。另外,大黃酸在7.68 min時出峰,血漿內源性物質不干擾測定,表明該方法專屬性良好。

2.6.4 方法學考察 取給藥后1.0 h血漿樣品,室溫下解凍后于0、2、6、12、24、48 h在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定,測得大黃酸峰面積RSD為2.14%,表明溶液在48 h內穩定性良好。取“2.6.3” 項下12.68、6.34、0.317 μg/mL血漿對照品溶液,同一天在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定6次,測得大黃酸日內精密度RSD分別為11.38%、7.62%、8.27%；每天測定1次,連續5 d,測得大黃酸日間精密度RSD分別為10.93%、8.44%、9.63%,表明該方法精密度良好。取100 μL空白血漿,甲醇依次稀釋至12.68、6.34、1.585 μg/mL,在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定6次,測得大黃酸方法回收率（測得質量濃度、初始質量濃度的比值）為92.87%～97.14%,RSD均小于5.96%。取 “2.6.3” 項下12.68、6.34、1.585 μg/mL血漿對照品溶液,按“2.6.2” 項下方法處理后在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定6次；另取“2.6.3” 項下不加空白血漿的上述3種質量濃度對照品溶液,在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定6次,測得大黃酸萃取回收率（加血漿、不加血漿對照品溶液峰面積的比值）為85.37%～91.61% 之間,RSD分別為9.91%、10.48%、8.43%。

2.6.5 分析結果 采用3P97程序統計矩模型計算主要藥動學參數,結果見表4,繪制血藥濃度-時間曲線,見圖9。由此可知,納米混懸劑t1/2、Cmax、AUC0～t、AUC0～∞高于原料藥 （P＜0.01）,tmax雖有所提前但差異無統計學意義（P＞0.05）,相對生物利用度提高至2.02倍。

表4 大黃酸主要藥動學參數（， n=6）Tab.4 Main pharmacokinetic parameters for rhein （，n=6）

表4 大黃酸主要藥動學參數（， n=6）Tab.4 Main pharmacokinetic parameters for rhein （，n=6）

注：與大黃酸比較,**P＜0.01。

圖9 樣品血藥濃度-時間曲線Fig.9 Plasma concentration-time curves for samples

3 討論

前期預實驗對聚山梨酯80、聚乙烯醇、磷脂、泊洛沙姆188等穩定劑進行了考察,發現所制得納米混懸劑均存在粒徑稍大、PDI＞0.3、穩定性差等問題［10-11］。本實驗將PVP K30與磷脂聯合應用后,有效改善了上述問題,其原因可能為PVP K30分子鏈具有一定延展性,可形成空間阻力而防止納米粒之間聚集［12-13］；磷脂吸附于納米粒表面時提供了電荷,可利用電荷排斥力來提高其穩定性［14-15］。據報道,大黃酸在70 ℃下可在3 h內保持穩定［16］,故本實驗的制備條件（45 ℃下磁力攪拌3 h）不會對大黃酸穩定性產生明顯影響。另外,在制備體系中加入大豆磷脂也有助于提高大黃酸的穩定性［17］。

體內藥動學研究結果顯示,大黃酸納米混懸劑凍干粉tmax較大黃酸略有提前,但無顯著差異,由于兩者該參數均較快,故在0.5 h內設置4個采血點；凍干粉t1/2、 Cmax、AUC0～t、AUC0～∞顯著高于原料藥,相對生物利用度提高至2.02倍,其原因可能是納米混懸劑口服進入機體后可增強藥物對腸道黏膜的黏附性,延長滯留時間,間接促進藥物吸收,同時也對其藥動學參數產生影響［18］,而且納米級藥物可在伊派爾結中大量聚集,通過淋巴結中的M細胞進入血液循環,從而改變了藥物吸收途徑及藥動學［19-22］。另外,大黃酸水溶性、脂溶性均不理想［5］,而納米混懸劑可不改變該成分脂溶性（透膜性）的同時影響其生物利用度,能為該劑型后續研究（如藥效學等）奠定基礎［23-24］。