小紅蒜總萘醌質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究

郭朋程，陳婕妤，劉思雨，葉祥睿，蘇 靖，邱明豐

（上海交通大學(xué)藥學(xué)院，上海 200240）

冠心病發(fā)病率及危險(xiǎn)因素水平逐年上升,并日趨年輕化,已經(jīng)成為“人類健康第一殺手” 的心血管疾病。傣藥小紅蒜又名紅蔥、紅蔥頭、百步還陽(yáng),其性涼,味苦,有活血散瘀、消腫止痛、止血、清熱解毒、利尿除濕之功效［1-3］,是傣醫(yī)治療冠心病的主要藥物,分布于我國(guó)海南、廣西、云南等省［4-5］。現(xiàn)代研究表明,小紅蒜主要有效成分為萘醌衍生物［6-9］,其醇提物中的總萘醌能顯著增加冠狀動(dòng)脈血流量,直接舒張血管,抑制苯腎上腺素和氯化鉀對(duì)血管環(huán)的預(yù)收縮作用［10-12］,以異紅蔥乙素、紅蔥乙素、紅蔥甲素為主。因此,本實(shí)驗(yàn)在前期工藝基礎(chǔ)上制備小紅蒜總萘醌,并在性狀、檢查、定性鑒別、定量測(cè)定等方面進(jìn)行研究,以期為該藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定和相關(guān)制劑的研發(fā)奠定基礎(chǔ)［13］。

1 材料

MiniQ超純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）；UV-759紫外可見分光光度計(jì)（上海奧譜勒儀器有限公司）；Agilent 1200高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；硅膠GF254薄層層析預(yù)制板（青島海洋化工廠分廠）；ZF-20D暗箱三用紫外分析儀（上海驥輝科學(xué)分析儀器有限公司）；KQ-250DB數(shù)控超聲波清洗儀（昆山超聲儀器有限公司）。異紅蔥乙素（批號(hào)DFZY-17110）、紅蔥乙素（批號(hào)DFZY-17111）、紅蔥甲素 （批號(hào)DFZY-17112）對(duì)照品（成都瑞芬思生物科技有限公司）。小紅蒜對(duì)照藥材（批號(hào)20160116,西雙版納傣族自治州食品藥品檢驗(yàn)所）、原料藥（批號(hào)20150909,云南金發(fā)藥業(yè)有限公司）均經(jīng)上海交通大學(xué)藥學(xué)院王夢(mèng)月副教授鑒定為鳶尾科植物紅蔥Eleutherine plicataHerb.的干燥鱗莖。小紅蒜總萘醌 （自制,批號(hào)20190402、20190412、20190426）。甲醇、乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀 本品為黃褐色粉末,氣微,味苦。

2.2 TLC定性鑒別 取3批本品粉末,每批約0.02 g,精密稱定,置于10 mL量瓶中,甲醇定容至刻度,搖勻,即得供試品溶液；取對(duì)照藥材適量,粉碎后過60目篩,取粉末約0.5 g至10 mL量瓶中,甲醇定容至刻度,超聲30 min,冷卻至室溫后甲醇定容至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得對(duì)照藥材溶液；取異紅蔥乙素、紅蔥乙素、紅蔥甲素對(duì)照品各約10 mg,精密稱定,置于同一10 mL量瓶中,甲醇定容至刻度,搖勻,即得對(duì)照品溶液。

方法1：取對(duì)照品溶液約5 μL、對(duì)照藥材及3批供試品溶液各約10 μL,點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上,以環(huán)己烷-甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5 ∶5 ∶3 ∶0.1）為展開劑,展開,取出,晾干,置于紫外光燈（254 nm）下檢視,結(jié)果見圖1,可知供試品在對(duì)照品相應(yīng)位置有相同斑點(diǎn)。

圖1 小紅蒜總萘醌TLC色譜圖（Ⅰ）Fig.1 TLC chromatogram of total naphthoquinones in E.plicata（Ⅰ）

方法2：取對(duì)照品溶液約5 μL、對(duì)照藥材及3批供試品溶液各約10 μL,點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上,以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸 （12 ∶1 ∶0.2）為展開劑,展開,取出,晾干,置于紫外光燈（254 nm）下檢視,結(jié)果見圖2,可知供試品在對(duì)照品相應(yīng)位置有相同斑點(diǎn)。

綜上所述,2種方法下TLC斑點(diǎn)均較清晰,分離度良好。

2.3 檢查

2.3.1 干燥失重 取3批本品,按照2015年版《中國(guó)藥典》 四部0831干燥失重測(cè)定法［14］進(jìn)行測(cè)定,測(cè)得干燥失重分別為3.91%、4.03%、2.34%,均小于5%,符合相關(guān)規(guī)定。

2.3.2 水分 取3批本品,按照2015年版《中國(guó)藥典》 四部0832水分檢測(cè)法［14］進(jìn)行測(cè)定,測(cè)得含水量分別為2.15%、3.56%、2.06%,均小于4%,符合相關(guān)規(guī)定。

圖2 小紅蒜總萘醌TLC色譜圖（Ⅱ）Fig.2 TLC chromatogram of total naphthoquinones in E.plicata（Ⅱ）

2.3.3 熾灼殘?jiān)?取3批本品,按照2015年版《中國(guó)藥典》 四部0841熾灼殘?jiān)鼨z查法［14］進(jìn)行測(cè)定,測(cè)得熾灼殘?jiān)謩e為0.15%、0.16%、0.19%,均小于0.2%,符合相關(guān)規(guī)定。

2.3.4 樹脂殘留物 取3批本品,按照2015年版《中國(guó)藥典》 四部0861殘留溶劑測(cè)定法［14］進(jìn)行測(cè)定,測(cè)得苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯質(zhì)量分?jǐn)?shù)均小于0.000 1%,正己烷、二乙烯苯質(zhì)量分?jǐn)?shù)均小于0.001%,符合相關(guān)規(guī)定。

2.4 總萘醌含有量測(cè)定

2.4.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取異紅蔥乙素對(duì)照品10.0 mg,置于5 mL量瓶中,甲醇稀釋至刻度,搖勻,精密吸取1 mL至25 mL量瓶中,甲醇稀釋至刻度,搖勻,即得（0.08 mg/mL）。

2.4.2 供試品溶液制備 將本品研細(xì),精密稱取12.5 mg,置于25 mL量瓶中,甲醇稀釋至刻度,搖勻,即得。

2.4.3 線性關(guān)系考察 取適量對(duì)照品溶液,甲醇依次稀釋至1、2、4、5、8、10 μg/mL,于208 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）,吸光度為縱坐標(biāo)（A）進(jìn)行回歸,得方程為A=0.101 8X+0.085 7 （r=0.999 4）,在1～10 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.4 精密度試驗(yàn) 精密量取4 μg/mL對(duì)照品溶液適量,按“2.4.3” 項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度6次,測(cè)得其RSD為0.31%,表明儀器精密度良好。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取供試品溶液1 mL至10 mL量瓶中,甲醇稀釋至刻度,搖勻,于0、2、4、8、12 h按“2.4.3” 項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度,測(cè)得其RSD為0.93%,表明溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗(yàn) 取總萘醌含有量已知的本品6份,每份約6.0 mg,精密稱定,置于25 mL量瓶中,精密加入含等量總萘醌的對(duì)照品溶液,甲醇稀釋至刻度,搖勻,精密移取0.1 mL至10 mL量瓶中,按“2.4.3” 項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度,計(jì)算回收率,結(jié)果見表1。

表1 總萘醌加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of recovery tests for total naphthoquinones（n=6）

2.4.7 分析結(jié)果 精密稱取3批本品,按“2.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,每批平行3份,分別精密量取1 mL至10 mL量瓶中,按“2.4.3” 項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度,計(jì)算含有量,結(jié)果見表2。

表2 總萘醌含有量測(cè)定結(jié)果（n=3）Tab.2 Results of content determination of total naphthoquinones （n=3）

2.5 異紅蔥乙素、紅蔥乙素、紅蔥甲素含有量測(cè)定

2.5.1 色譜條件與專屬性考察 Agilent TC-C18（2）色譜柱（250 mm×4.6 mm,5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-0.1% 磷酸 （B）,梯度洗脫 （0～25 min,40%A；25～30 min,40%～80% A；30～35 min,80%A）；體積流量1 mL/min；柱溫40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；進(jìn)樣量10 μL,色譜圖見圖3。由此可知,各成分色譜峰與相鄰峰的分離度均大于1.5,理論塔板數(shù)按各成分計(jì)均大于3 000,表明該方法專屬性良好。積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸,結(jié)果見表3,可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖3 各成分HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of various constituents

表3 各成分線性關(guān)系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.5.2 對(duì)照品溶液制備 分別精密稱取異紅蔥乙素、紅蔥乙素、紅蔥甲素對(duì)照品10.00、9.60、4.96 mg,置于5 mL量瓶中,甲醇稀釋至刻度,振蕩溶解,搖勻,分別精密吸取1、3、2 mL至10 mL量瓶中,甲醇稀釋至刻度,搖勻,即得（0.200 0、0.576 0、0.198 4 mg/mL）

2.5.3 供試品溶液制備 精密稱取小紅蒜總萘醌對(duì)照品12.5 mg,置于25 mL量瓶中,甲醇定容至刻度,搖勻,濾過,即得。

2.5.4 線性關(guān)系考察 取對(duì)照品溶液5、2.5、1.25、0.5、0.25 mL至10 mL量瓶中,甲醇依次稀釋至不同質(zhì)量濃度,在“2.5.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）,峰面

2.5.5 精密度試驗(yàn) 取含0.050 0 mg/mL異紅蔥乙素、0.144 mg/mL紅蔥乙素、0.049 6 mg/mL紅蔥甲素的對(duì)照品溶液,在“2.5.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,測(cè)得三者峰面積RSD分別為0.73%、0.97%、0.68%,表明儀器精密度良好。

2.5.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液,分別于0、2、4、8、12、24 h,在“2.5.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,測(cè)得異紅蔥乙素、紅蔥乙素、紅蔥甲素峰面積RSD分別為1.96%、1.63%、1.73%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批本品,按“2.5.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液,在“2.5.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,測(cè)得異紅蔥乙素、紅蔥乙素、紅蔥甲素含有量RSD分別為1.96%、1.63%、1.73%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取小紅蒜總萘醌對(duì)照品6.0 mg,置于25 mL量瓶中,精密加入含等量異紅蔥乙素、紅蔥乙素、紅蔥甲素的對(duì)照品溶液,甲醇稀釋至刻度,平行6份,在“2.5.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算回收率,結(jié)果見表4。

表4 異紅蔥乙素、紅蔥乙素、紅蔥甲素加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.4 Results of recovery tests for isoeleutherin，eleutherin and eleutherol （n=6）

2.5.9 分析結(jié)果 精密稱取3批本品,按“2.5.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,每批平行3份,在“2.5.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算含有量,結(jié)果見表5。

表5 異紅蔥乙素、紅蔥乙素、紅蔥甲素含有量測(cè)定結(jié)果（n=3）Tab.5 Results of content determination of isoeleutherin，eleutherin and eleutherol （n=3）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)紫外掃描情況,確定檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm；考察了流動(dòng)相甲醇-0.1% 磷酸、乙腈-0.1%磷酸的分離效果,發(fā)現(xiàn)后者優(yōu)于前者,并對(duì)其梯度洗脫比例進(jìn)行優(yōu)化。最終,確定為“2.5.1” 項(xiàng)下色譜條件。

小紅蒜總萘醌是治療冠心病傣藥小紅蒜的有效部位,主要含有異紅蔥乙素、紅蔥乙素、紅蔥甲素,具有巨大開發(fā)潛力。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果,初步建議小紅蒜總萘醌干燥失重不得超過5%,含水量不得超過4.0%,熾灼殘?jiān)坏贸^0.2%,樹脂殘留物（苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯）質(zhì)量分?jǐn)?shù)均不得超過0.000 1%,正己烷、二乙烯苯質(zhì)量分?jǐn)?shù)均不得超過0.001%,萘醌類成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得低于70%,異紅蔥乙素、紅蔥乙素、紅蔥甲素總質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得低于60%。