雷公藤多苷通過Wnt/β-catenin緩解IL-1β 誘導的軟骨細胞損傷

齊秀春，陳 昕，曹玉凈，李 揚，艾進偉，李浩亮

（河南省中醫院骨傷科，河南鄭州 450002）

創傷性關節炎是踝關節骨折治療后容易發生的一種并發癥,主要呈現出嚴重的腫脹和疼痛,危害踝關節的功能,影響患者的身體健康和正常生活［1］。它主要表現為關節軟骨的變性和破壞,受損的軟骨組織修復與再生能力較弱,因此創傷后造成的軟骨損傷及退變成為臨床修復的難題［2］。雷公藤多苷是從衛矛科植物雷公藤Tripterygium wilfordiiHook.f.中提取的一種水-氯仿提取物,具有較強的抗炎及免疫抑制作用［3-4］。因此,本研究擬通過體外培養軟骨細胞并加入白介素1β（IL-1β）模擬創傷性關節炎時軟骨細胞的環境,檢測不同濃度雷公藤多苷對軟骨細胞活性和功能的影響,以期為創傷性關節炎的治療提供理論依據。

1 材料

1.1 動物 SD大鼠（雄性,4周,體質量60～80 g）購自河南省中醫院中心實驗室（使用許可證號SYXK （豫）2016-0009）。

1.2 藥物與試劑 雷公藤多苷片購于江蘇美通制藥有限公司（批號151206,規格10 mg/片）,加入少量DMEM培養液充分溶解,以0.45 μm濾膜過濾除菌,用含10%胎牛血清的DMEM培養液分別稀釋至5、10、25、50 μg/mL。DMEM低糖培養基（批號 C11885500BT ）、胎牛血清 （批號C20012500BT）、含50 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的雙抗（批號15140-122）、胰蛋白酶（批號25200-056）購于美國Gibco公司；氯化鋰（LiCl）溶液（批號R00473,規格1 mol/L）購自北京雷根生物技術有限公司,蒸餾水稀釋至20 mmol/L；CCK-8細胞活性檢測試劑盒 （批號KGA317）、LDH檢測試劑盒 （批號KGT02424）、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒 （批號KGA1012）購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；Col-Ⅱ（批號69-98687）、葡萄糖氨基聚糖（glycosaminoglycan,GAG）（批號69-98547）、COX-2 （批號69-36228）、iNOS （批號69-98762）ELISA檢測試劑盒,BCA蛋白檢測試劑盒（批號69-97682）購自武漢默沙克生物科技有限公司；ECL顯色劑（批號P0018FS）購于上海碧云天生物技術有限公司；兔抗鼠MMP13 （批號ab219620）、Aggrecan（Acan）（批號ab186414）、Sox9 （批號ab185966）單克隆抗體及辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG（批號ab172730）購于英國Abcam公司。

2 方法

2.1 軟骨細胞分離培養 將SD大鼠處死,消毒后剪開膝關節,用刀片刮取關節表面軟骨,放入加有PBS的培養皿中,清除表面血污及附著組織,用PBS溶液沖洗后,將軟骨剪切到1 mm3大小的組織塊放入無菌培養皿內,加入0.25% 胰蛋白酶在恒溫搖箱中37 ℃下搖蕩消化30 min。棄去上清液,加入2 mg/mL的Ⅱ型膠原酶,放入恒溫搖箱中37 ℃下搖蕩消化2～4 h,低溫離心5 min后棄去上清液,DMEM培養液沖洗3次,加入含有10%胎牛血清的DMEM培養基。將含有完全培養基的組織塊均勻鋪在培養瓶內,再加入適量完全培養基,繼續放在培養箱中靜置培養,每2～3天換液1次,待組織塊中軟骨細胞長出后,傳代培養,取第3代軟骨細胞進行后續實驗。

2.2 分組、造模及CCK-8檢測軟骨細胞存活率取第3代軟骨細胞,以2×103/孔接種于96孔板中,分別用不同濃度雷公藤多苷（0、5、10、25、50 μg/mL）處理24 h,其中未加雷公藤多苷的細胞組作為對照組,每孔加入20 μL CCK-8溶液,用加了相應量細胞培養液和CCK-8溶液但沒有加入細胞的孔作為空白對照,繼續孵育培養2～4 h。在酶聯免疫檢測儀上檢測450 nm處的吸光度值（OD）。細胞存活率=［（OD給藥組-OD空白組）/（OD對照組-OD空白組）］×100%。第3代軟骨細胞分為對照組、模型組（10 ng/mL IL-1β）、雷公藤多苷組 （10、50 μg/mL雷公藤多苷）、LiCl組（50 μg/mL雷公藤多苷+20 mmol/L LiCl）,加入10 ng/mL IL-1β 誘導軟骨細胞24 h,給藥組加入相應藥物繼續處理24 h。按上述CCK-8法,檢測各組細胞存活率。

2.3 LDH釋放率檢測 取第3代軟骨細胞,以5×104/孔的濃度接種于培養瓶中,按照“2.2” 項下分組處理細胞,根據LDH檢測試劑盒檢測各組細胞中LDH釋放量。LDH釋放率=［細胞上清液中LDH水平/ （細胞上清液LDH水平+細胞裂解液中LDH水平）］×100%,結果以實驗組與對照組LDH釋放率的比值來表示。

2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡檢測 取第3代軟骨細胞,按照 “2.2” 項下分組處理細胞后,0.25%胰蛋白酶加入到各組的培養皿中消化收集細胞,按照Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒的說明書進行操作,將細胞重懸后加入Annexin V-FITC和PI,室溫避光條件下分別孵育15、5 min。最后,通過流式細胞儀檢測細胞凋亡。

2.5 檢測細胞培養上清液中COX-2和iNOS的水平 取第3代軟骨細胞,按照“2.2” 項下分組處理細胞后,收集細胞培養上清液,按照ELISA試劑盒說明書進行操作,檢測細胞培養上清液中COX-2和iNOS的水平。

2.6 葡萄糖氨基聚糖 （glucose aminoglycan，GAG）水平檢測 取第3代軟骨細胞,按照“2.2”項下分組處理細胞后,換液時的培養液100 μL,加入至含1.5 mL 1.5% 阿利新藍染液的試管內,室溫放置10 min,酶標儀在490 nm波長處吸光度值（OD）。以硫酸軟骨素制作標準對照曲線,計算出各組細胞培養液GAG水平。

2.7 Western blot檢測蛋白表達 取第3代軟骨細胞,按照“2.2” 項下分組處理細胞后,收集細胞總蛋白,BCA試劑盒檢測蛋白濃度,每孔上樣量為20 μg,進行SDS-PAGE電泳,轉移至PVDF膜,將PVDF膜于5% 脫脂奶粉4 ℃封閉過夜,加入Wnt3a （1 ∶800）和β-catenin抗體 （1 ∶1 000）4 ℃孵育過夜,TBST洗滌,加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG搖床孵育1 h,常規洗膜化學發光試劑顯色。Quantity One軟件分析灰度值。

2.8 RT-PCR檢測mRNA表達 取第3代軟骨細胞,按照“2.2” 項下分組處理細胞后,收集細胞并提取總RNA,按照M-MLV逆轉錄試劑盒說明轉錄cDNA,引物序列為MMP13 （正向5′-CTTCCCAACCGTATTGATGC-3′,反向5′-TTTGGAAGACCCAGTTCAGA-3′）； Acan（正向 5′-TCGAGGACA GCGAGGCC-3′,反向 5′-TCGAGGGTGTAGCGTGTAGAGA-3′）； Sox-9 （正向 5′-TACGACTGGAC GCTGGTGCC-3′,反向 5′-CCGTTCTTCACCGACTTCCTCC-3′）； GAPDH（正向5′-ATG TTCGTCATGGGTGTGAA-3′,反向5′-GGTGCTAAGCAGTTGGTGGT-3′。取cDNA進行擴增。反應條件為預變性95 ℃、30 s；變性65 ℃、3 s,退火72 ℃30 s,共40個循環。用2-ΔΔCt法計算出各個mRNA的相對表達量。

2.9 統計學分析 應用SPSS17.0統計軟件進行統計學分析,所有細胞實驗每組設3個復孔,每個實驗獨立實驗重復3次,計量資料以（）表示,使用GraphPad Prism 7.0制圖,多組間比較用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗,以P≤0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 雷公藤多苷對IL-1β 誘導軟骨細胞增殖和毒性影響 CCK-8檢測結果表明,與對照組比較,雷公藤多苷（5、10、25、50 μg/mL）作用之后,軟骨細胞存活率及細胞內LDH水平無變化（圖1A～1B）。與對照組比較,模型組細胞存活率降低（P＜0.05）LDH釋放升高（P＜0.05）；與模型組比較,雷公藤多苷（50 μg/mL）干預后,細胞存活率升高（P＜0.05）,LDH釋放降低（P＜0.05）（圖1C～1D）。

3.2 雷公藤多苷抑制IL-1β 誘導的軟骨細胞凋亡流式細胞儀檢測結果表明,與對照組比較,模型組細胞凋亡率上升（P＜0.05）,而雷公藤多苷作用之后,細胞凋亡率降低（P＜0.05）。結果表明,雷公藤多苷可以降低IL-1β 誘導的細胞凋亡。見圖2。

3.3 雷公藤多苷緩解IL-1β 誘導的軟骨細胞退化及炎癥反應 與對照組比較,模型組GAG水平降低,而雷公藤多苷作用之后,細胞中GAG水平上升（圖3A,P＜0.05）；與對照組比較,模型組COX-2和iNOS水平升高,而雷公藤多苷作用之后,細胞中COX-2和iNOS水平降低（圖3B,P＜0.05）；與對照組比較,模型組細胞中MMP13 mRNA升高,Acan、 Sox-9 mRNA下降,而雷公藤多苷作用后,細胞中MMP13 mRNA降低,Acan、Sox-9 mRNA上升（圖3C,P＜0.05）。結果表明,雷公藤多苷可以降低IL-1β 誘導的軟骨退化及炎癥反應。

3.4 雷公藤多苷抑制IL-1β 誘導軟骨細胞中Wnt/β-catenin通路的激活 Western blot結果表明,與對照組比較,模型組細胞中Wnt3a和β-catenin的表達上調,而雷公藤多苷作用之后細胞中Wnt3a和β-catenin表達下降（P＜0.05）,見圖4。結果表明雷公藤多苷可以抑制IL-1β 誘導軟骨細胞中Wnt/β-catenin通路的激活。

圖1 雷公藤多苷對IL-1β 誘導軟骨細胞增殖和毒性影響（n=3）Fig.1 Effects of tripterygium glycosides on the proliferation and cytotoxicity of IL-1β-induced chondrocytes （n=3）

圖2 雷公藤多苷對IL-1β 誘導的軟骨細胞凋亡的影響（n=3）Fig.2 Effects of tripterygium glycosides on the apoptosis of IL-1β-induced chondrocytes （n=3）

3.5 雷公藤多苷通過抑制Wnt/β-catenin通路緩解IL-1β 誘導的軟骨細胞損傷 為了檢測雷公藤多苷是否通過抑制Wnt/β-catenin通路緩解IL-1β 誘導的軟骨細胞損傷,將Wnt/β-catenin通路激動劑LiCl作用于雷公藤多苷干預的IL-1β 誘導的軟骨細胞。Western blot結果表明,LiCl作用之后細胞中Wnt3a和β-catenin的表達上升（圖5A,P＜0.05）；與雷公藤多苷組比較,LiCl激動劑作用之后細胞存活率降低（P＜0.05）,LDH釋放上升（P＜0.05）,細胞凋亡率增加（P＜0.05）,GAG水平及Acan、Sox-9 mRNA降低 （P＜0.05）,MMP13 mRNA及COX-2、iNOS水平上升（P＜0.05）,均逆轉了雷公藤多苷對IL-1β 誘導的細胞損傷的緩解作用。結果表明,雷公藤多苷通過抑制Wnt/β-catenin通路緩解IL-1β 誘導的軟骨細胞損傷。

4 結論

圖3 雷公藤多苷對IL-1β 誘導的軟骨細胞退化及炎癥反應的影響（n=3）Fig.3 Effects of tripterygium glycosides on the degeneration and inflammation of IL-1β-induced chondrocytes （n=3）

圖4 雷公藤多苷對IL-1β 誘導軟骨細胞中Wnt/β-catenin通路的影響（n=3）Fig.4 Effects of tripterygium glycosides on Wnt/β-catenin Pathway of IL-1β-induced chondrocytes （n=3）

關節軟骨是固態的結締組織,由分布在其中的特異性軟骨細胞及大量的細胞外基質組成。軟骨基質中含有水分、蛋白多糖和膠原纖維,還包括一些脂肪、蛋白質、糖蛋白和無機鹽等［5-6］。創傷性關節炎導致的軟骨、滑膜損傷及變性將導致關節功能障礙,其中炎癥是創傷性關節炎病理變化過程中的重要環節［7］。因此,本研究通過IL-1β 誘導軟骨細胞模擬創傷性關節炎發生的軟骨細胞環境,探究雷公藤多苷對創傷性關節炎軟骨細胞的保護作用及其潛在的分子機制。

雷公藤多苷具有抗炎、抗腫瘤和免疫抑制等多種生物功能,其活性主要由二萜內酯、生物堿和三萜等多種有效成分協同產生。在臨床上,雷公藤多苷主要用于風濕性關節炎、急性腎小球腎炎和強直性脊柱炎等自身免疫性疾病和炎癥性疾病的治療［8］。有研究表明,使用雷公藤多苷治療關節炎模型大鼠之后,大鼠的足腫脹度、關節炎癥指數均顯著降低,且其機制可能是雷公藤多苷上調了調節性T細胞以及炎性細胞抑制因子白介素10水平［9］。環氧合酶（Cyclooxygenase-2,COX-2）是前列腺素合成和起始步驟的關鍵酶,而前列腺素與滑膜、軟骨破壞,關節周圍組織炎癥等病變過程息息相關［10］。誘導型一氧化氮合成酶 （induced nitric oxide synthase,iNOS）在軟骨細胞損傷和退變中發揮重要作用。目前很多研究證實,iNOS抑制劑的應用有助于炎性軟骨代謝的恢復。iNOS抑制劑能抑制iNOS的表達,減少軟骨細胞產生NO的同時,抑制基質金屬蛋白酶（MMPs）和膠原酶的活性及基因表達,使軟骨細胞合成蛋白多糖的能力逐漸恢復,并能抑制自由基和IL-1β 誘發的軟骨細胞凋亡［11-12］。葡萄糖氨基聚糖（GAG）是軟骨基質的主要成分,軟骨基質合成關鍵基因Acan、Sox-9蛋白等的水平均作為關節炎癥中軟骨損傷的指標受到廣泛的研究［13-14］。另外,MMP13是唯一能夠裂解膠原分子中三維螺旋結構的酶,對膠原具有特異性,軟骨破壞中研究較多［15］。本研究表明,IL-1β誘導之后,軟骨細胞的增殖活性降低,細胞凋亡率增加,COX-2,iNOS的表達水平提高,GAG、Acan和Sox-9的水平降低,而雷公藤多苷作用之后細胞活性上升,炎性相關COX-2、iNOS的表達水平降低,GAG、Acan和Sox-9的水平提高。結果表明,雷公藤多苷能夠保護IL-1β 誘導的軟骨損傷。

圖5 雷公藤多苷通過抑制Wnt/β-catenin通路緩解IL-1β 誘導的軟骨細胞損傷（n=3）Fig.5 Alleviation of IL-1β-induced chondrocyte injury by tripterygium glycosides via Wnt/β-catenin pathway inhibition （n=3）

Wnt信號通路包含多種通路系統,調節生細胞形態與功能的分化與維持、免疫、應激等過程,其中典型的Wnt/β-catenin通路在關節炎中具有至關重要的作用［16］。Wnt/β-catenin通路的激活增強腫瘤壞死因子（TNF）-α 的分泌,促進MMP的生成,從而導致細胞外基質降解,引起關節軟骨破壞。有研究表明,雷公藤多苷能夠通過抑制Wnt/β-catenin通路延緩糖尿病腎病的進展［17］。為了檢測Wnt/β-catenin通路的抑制是否同樣參與了雷公藤多苷對IL-1β 誘導的軟骨細胞損傷的保護作用,我們將Wnt/β-catenin通路的激活劑作用于雷公藤多苷處理的軟骨細胞損傷模型中,結果表明,Wnt/β-catenin通路的激活劑反轉了雷公藤多苷對IL-1β 誘導的軟骨細胞的保護作用。

綜上所述,雷公藤多苷可能通過抑制Wnt/βcatenin通路反轉IL-1β 誘導的軟骨細胞活性降低、LDH分泌和細胞凋亡率的增加,以及GAG、MMP13、Acan、Sox-9水平的降低和COX-2,iNOS水平的上升等,以期這一結果為創傷性關節炎的臨床治療提供理論支持。