活血止痛膠囊砷形態的分析

方 靜，朱 瓊，蔡 鵬，錢保勇

（泰州市食品藥品檢驗所，江蘇泰州 225300）

活血止痛膠囊由當歸、三七、乳香（制）、冰片、土鱉蟲、自然銅（煅）6味藥材組成,具有活血散瘀、消腫止痛之功效,用于治療跌打損傷、淤血腫痛等［1-3］,方中自然銅主要含有二硫化鐵,此外還有少量鋁、鈣、鎂、鈦、硅、砷,以及微量銅、鉛、鋅、錳、鎳、鉻等20余種元素［4］。不同價態、形態砷對人體毒性的差別很大,依次為亞砷酸鹽＞砷酸鹽＞一甲基砷＞二甲基砷＞砷甜菜堿＞砷膽堿［5-7］,故為了更好地對活血止痛膠囊毒性及用藥安全進行評價,應對其砷形態進行分析。

目前,國內分析砷形態時主要采用選擇性好、靈敏度高的高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜（HPLC-ICPMS）法［8-10］。本實驗為了反映活血止痛膠囊經口服進入人體后可溶性砷的存在形態,模擬人體胃腸道環境,環境將該制劑以水、人工胃液、人工腸液提取,并采用HPLCICP-MS法進行分析,以期為其砷限量標準建立及用藥安全評價提供依據［11］。

1 材料

UltiMate3000型高效液相色譜儀,配置ICP-Q型電感耦合等離子體質譜儀、IonPacTMAS7型陰離子交換樹脂柱（4 mm×250 mm）,采樣錐、截取錐均為鎳（美國Dionex公司）；Milli-Q Reference型超純水處理系統（美國密理博公司）；SHA-C型恒溫振蕩器（常州國華電器有限公司）。

亞砷酸鹽［編號1604,含砷（75.7±1.2）μg/g］、砷酸鹽［編號1512,含砷（17.5±0.4）μg/g］、一甲基砷［編號16072,含砷（25.1±0.8）μg/g］、二甲基砷［編號1607,含砷（52.9±1.8）μg/g］、砷甜菜堿［編號1509,含砷 （38.8±1.1）μg/g］、砷膽堿 ［編號1512,含砷（28.0±1.1）μg/g］標準溶液均購自中國計量科學研究院；Ba、Bi、Ce、Co、Zn、Li、U質譜調協液（編號1323770,3～35 μg/L）均購自美國Thermo Scientific公司。碳酸銨（批號1000148）購自國藥集團化學試劑有限公司；甲醇為色譜純,購自德國默克公司。

活血止痛膠囊共6批,批號分別為20161103 （江西百神藥業股份有限公司）、170211 （南京中山制藥有限公司）、1501026 （江西百神昌諾藥業有限公司）、15060162（珠海安生鳳凰制藥有限公司）、16060139 （珠海安生鳳凰制藥有限公司）、17010101 （珠海安生鳳凰制藥有限公司）。

2 方法與結果

2.1 工作參數 流動相200 mmol/L （NH4）2CO3（A）-10 mmol/L （NH4）2CO3（B）,梯度洗脫,程序見表1；體積流量1.0 mL/min；進樣量25 μL；等離子體功率1 550 W；采樣深度5 mm；載氣體積流量0.91 L/min；蠕動泵轉速40 r/min；冷卻氣體積流量14 L/min；輔助氣體積流量0.8 L/min；采樣錐、截取錐類型鎳錐；標準采樣模式（STD）；手動進樣；采樣質荷比m/z75 （砷）。

表1 梯度洗脫程序

2.2 標準溶液制備 精密稱取亞砷酸鹽、砷酸鹽、一甲基砷、二甲基砷、砷甜菜堿、砷膽堿標準溶液適量,超純水分別稀釋至1 041、1 006、1 001、1 004、1 019、1 005 μg/L（以砷計）,再用超純水各逐級稀釋成6個質量濃度,分別為亞砷酸鹽1.04、2.08、4.16、8.33、16.7、20.82 μg/L,砷酸鹽1.01、2.01、4.02、8.05、16.10、20.12 μg/L,一甲基砷1.00、2.00、4.00、8.01、16.02、20.02 μg/L,二甲基砷1.00、2.01、4.02、8.03、16.06、20.08 μg/L,砷甜菜堿1.02、2.04、4.08、8.15、16.30、20.38 μg/L,砷膽堿1.00、2.01、4.02、8.04、16.08、20.10 μg/L。

2.3 提取液制備

2.3.1 人工胃液 按照2015年版《中國藥典》 四部通則0922［12］,取16.4 mL稀鹽酸,加水約800 mL、胃蛋白酶10 g,搖勻后加水稀釋至1 000 mL,即得。

2.3.2 稀鹽酸溶液 按照2015年版《中國藥典》 四部,取234 mL鹽酸,加水稀釋至1 000 mL,即得。

2.3.3 人工腸液 按照2015年版《中國藥典》 四部通則8004［12］,取6.8 g磷酸二氫鉀,加500 mL水溶解,0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調節pH至6.8；另取10 g胰酶,加適量水溶解,將上述2種溶液混合,加水至1 000 mL,搖勻,即得。

2.4 樣品前處理

2.4.1 人工胃液提取物 精密稱取適量膠囊粉末至錐形瓶中,加入100 mL人工胃液,37 ℃下振蕩提取1 h,濾過,少量人工胃液清洗濾渣3次,合并濾液,加人工胃液定容至200 mL,搖勻,0.20 μm微孔濾膜過濾,即得。

2.4.2 人工腸液提取物 人工胃液改成人工腸液,其他操作同“2.4.1” 項,即得。

2.4.3 水提取物 精密稱取適量膠囊粉末至錐形瓶中,加100 mL水,37 ℃下振蕩提取5 h,濾過,少量水清洗濾渣3次,合并濾液,加水定容至200 mL,搖勻,0.20 μm微孔濾膜過濾,即得。

2.5 線性關系考察 取“2.2” 項下標準溶液,在“2.1”項工作參數下各進樣25 μL測定。以溶液質量濃度為橫坐標（X）,峰面積為縱坐標（Y）進行回歸,再分別為以S/N=3、S/N=10測定檢出限、定量限,結果見表2,可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表2 各成分線性關系

2.6 精密度試驗 取人工胃液（批號20161103）提取物適量,在“2.1” 項工作參數下進樣測定6次,測得亞砷酸鹽、砷酸鹽峰面積RSD分別為0.96%、2.75% （一甲基砷、二甲基砷、砷甜菜堿、砷膽堿未檢測出）,表明儀器精密度良好。

2.7 穩定性試驗 取同一份供試品溶液 （批號20161103）,4 ℃下于0、2、4、6 h在“2.1” 項工作參數下進樣測定,測得亞砷酸鹽、砷酸鹽峰面積RSD分別為1.08%、2.03%,表明供試品溶液在6 h內穩定性良好。

2.8 加樣回收率試驗 精密量取人工胃液提取液（批號20161103）10 mL,精密加入供試品溶液1、3、5 mL,混勻,平行3份,在“2.1” 項工作參數下進樣測定,結果見表3。

2.9 樣品砷形態含有量測定 取6批膠囊,分別按“2.4”項下方法制備水、人工胃液、人工腸液提取物,在“2.1”項工作參數下進樣測定,平行6次,離子流色譜圖見圖1,結果見表4。由此可知,不同廠家、批次樣品中均只檢出無機砷（亞砷酸鹽、砷酸鹽）,以砷酸鹽為主,其總含有量差異較大,在人工胃液提取物中較高。

表3 各砷形態加樣回收率試驗結果（n=3）

圖1 各砷形態離子流色譜圖

表4 各砷形態含有量測定結果（μg/g， n=6）

3 討論

本實驗考察了磷酸二氫銨、碳酸銨作為流動相時的洗脫效果,發現前者易污染采樣錐,導致質譜熄火,而后者能較好地避免該類情況發生,故選擇其作為流動相。再通過不斷調節流動相濃度及比例、更改洗脫時間,最終建立了同時測定活血止痛膠囊中亞砷酸鹽、砷酸鹽、一甲基砷、二甲基砷、砷甜菜堿、砷膽堿含有量。

前期報道,活血止痛膠囊無機砷在水、人工胃液、人工腸液中的溶出總量遠低于總砷。2015年版《中國藥典》一部規定,活血止痛膠囊含砷量不得超過300 mg/kg［13］,但未涉及無機砷。因此,可考慮以亞砷酸鹽、砷酸鹽總含有量代表無機砷總含有量,從而制定相關限量標準,但其毒性和用藥安全仍需作進一步研究。

表4顯示,不同廠家、批次活血止痛膠囊中無機砷含有量差異較大,可能與原藥材質量不同有關。因此,可通過測定原藥材中無機砷含有量來將活血止痛膠囊中該類元素總量控制在安全范圍內。