血必凈注射液對急性胰腺炎大鼠肺損傷及肺組織TLR4、NF-κB、TNF-α表達的影響

董小鵬王麗娟 趙春霖張建平潘海邦易劍鋒石育弘

（1.甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅蘭州 730000；2.甘肅省中藥藥理與毒理重點實驗室，甘肅蘭州 730000；3.甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，甘肅蘭州 730020）

急性胰腺炎（acute pancreatitis,AP）是以胰腺外分泌部的炎癥為特征,其發(fā)生發(fā)展與腺泡細胞損傷和局部和全身炎癥反應有關。根據(jù)發(fā)病速度和病情嚴重程度,在2012年亞特蘭大國際共識修訂分類中將其分為3種類型：輕度胰腺炎 （mild acute pancreatitis,MAP）、中度胰腺炎（moderately severe acute pancreatitis,MSAP）和重度胰腺炎（severe acute pancreatitis,SAP）［1］。AP一般起病較急,尤其SAP病情進展迅速,且伴有多種并發(fā)癥。其中,以急性肺損傷（acute lung injury,ALI）和急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome,ARDS）最為常見,這也是胰腺炎引起死亡的主要原因［2-3］。近年來,AP發(fā)病率逐年增高,每年增幅3.4%左右［4］,與此同時對于AP各種并發(fā)癥尤其ALI缺少有效安全的藥物,因此迫切需要積極開始實驗及臨床研究尋找研發(fā)相應治療藥物。血必凈注射液屬于國家二類新藥,臨床研究表明血必凈注射液可顯著改善SAP患者體內氧化應激狀態(tài),抑制炎癥反應,用于SAP患者的治療并具有潛在肺功能保護作用［5-7］。實驗研究結果提示血必凈注射液能夠降低AP大鼠血清細胞因子TNF-α、IL-1β （白細胞介素-1β）和IL-6 （白細胞介素-6）的水平,通過抑制炎癥反應來改善胰腺組織病理損傷［8］,但對于AP引發(fā)肺損傷的治療機制研究報道較少。因此,本研究首先利用生物信息學方法分析出AP肺損傷發(fā)病過程中可能的靶點及其功能,同時建立AP大鼠模型觀察血必凈注射液對肺組織TLR4、NF-κB、TNF-α 表達水平的影響,以期為今后血必凈注射液的臨床推廣及治療機制研究提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 高通量芯片數(shù)據(jù)庫 從GEO數(shù)據(jù)庫［9］（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中檢索與AP與ALI相關的高通量轉錄組芯片數(shù)據(jù)。根據(jù)研究物種和樣本數(shù)量,選擇Hedegger K等提交的GSE121038數(shù)據(jù)集和XU W等提交的GSE48787數(shù)據(jù)集。GSE121038存儲用雨蛙肽制備的AP模型小鼠和正常小鼠胰腺組織轉錄組芯片數(shù)據(jù),每組各4個樣本,樣本編號分別為GSM3424904～GSM3424907及GSM3424908～GSM3424911。GSE48787存儲用脂多糖制備的ALI模型小鼠和正常小鼠肺組織轉錄組的芯片數(shù)據(jù),每組各選3個樣本,樣本編號分別為GSM118462～GSM118462及GSM1184630～GSM1184632。

1.2 實驗動物 SPF級SD大鼠48只,雌雄各半,體質量（220±20）g。由甘肅中醫(yī)藥大學SPF級動物實驗中心提供。實驗動物生產許可證號SCXK （甘）2015-0002。

1.3 藥物及主要試劑 血必凈注射液（天津紅日藥業(yè)股份有限公司,批號1809101,規(guī)格10 mL/支,主要成分是紅花、赤芍、川芎、丹參、當歸）；牛磺膽酸鈉（北京索萊寶公司,批號20200909,規(guī)格25 g,使用前用0.9%生理鹽水配成5% 質量濃度）；TLR4 （bs-20594R）、NF-κB （bs-2695R）、TNF-α （bsm-0387M）雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（北京博奧森生物技術有限公司）。

1.4 主要儀器 BS110電子天平（德國賽多利斯公司）；TEC5組織包埋機（北京怡康勇佳科技有限責任公司）；QPJ-1C型石蠟切片機（天津愛華醫(yī)療器械有限公司）；olympusVanox型光學顯微鏡（日本Olympus公司）；DZF-1AS真空干燥箱（北京科偉永興儀器有限公司）。

2 方法

2.1 疾病相關高通量芯片數(shù)據(jù)DEGs篩選及相關通路分析 DEGs是在轉錄水平發(fā)生表達量改變的一些基因,可能在疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。在GSE121038和GSE48787數(shù)據(jù)集中,利用GEO數(shù)據(jù)庫自帶的在線分析工具GEO2R分別篩選AP相關的DEGs及ALI相關的DEGs。篩選標準為①adj P＜0.05；② | log FC| ≥1.5。分別選取2個數(shù)據(jù)集的上調DEGs和下調DEGs取交集,作為AP伴發(fā)ALI的DEGs進行后續(xù)分析。在KEGG數(shù)據(jù)庫［10］（https：//www.kegg.jp/kegg/mapper.html）輸入上述篩選的DEGs及相應物種信息,檢索DEGs相關的信號通路。

2.2 動物分組、疾病模型制備及給藥 大鼠按體質量分層隨機分為假手術組、AP模型組、血必凈注射液組,16只/組。適應性喂養(yǎng)1周。造模前各組大鼠均禁食12 h,自由飲水。本實驗采用牛磺膽酸鈉制備AP實驗動物模型。采用10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠后仰臥位固定于無菌手術臺上。腹部備皮、消毒,開腹后在胰腺被膜下多點注射5%牛磺膽酸鈉,當胰腺顏色由淡粉色變?yōu)樯罴t色時關閉腹腔。假手術組在開腹后僅輕輕翻動胰腺及十二指腸數(shù)次即可關腹。造模結束后,將大鼠以右側臥位放回鼠籠,禁食、水,并注意保溫,同時密切觀察其生命狀態(tài)。血必凈注射液組大鼠造模前12 h、造模后10 min內、6、24 h分別腹腔注射血必凈注射液4 mL/kg,其余各組大鼠在相同時間點腹腔注射等體積生理鹽水。

2.3 樣本采集及指標檢測 于造模后6、24 h 2個時間點每組隨機選取8只大鼠心臟取血,分離血清用于AMY檢測。處死大鼠后取出胰腺和肺臟,用于組織病理學觀察及肺臟組織TLR4/NF-κB表達水平的檢測。

2.3.1 血清AMY檢測 利用AMY ELISA試劑盒檢測各組大鼠血清AMY活性,具體操作嚴格按照說明書進行。

2.3.2 胰腺及肺臟組織病理學觀察 處死大鼠開腹后,觀察腹水顏色、胰腺組織及胰周組織器官的形態(tài)變化。取出部分胰腺經甲醛固定。打開胸腔后觀察肺臟病理學變化,取出部分右肺經甲醛固定。甲醛固定的組織經梯度酒精脫水,二甲苯浸透和石蠟包埋,切片,進行HE常規(guī)組織學染色。

2.3.3 肺臟TLR4、NF-κB、TNF-α 表達水平檢測 取出大鼠部分左肺制備組織勻漿,利用相應ELISA試劑盒檢測肺臟中TLR4、NF-κB、TNF-α 表達水平,嚴格按照說明書進行操作。

2.4 統(tǒng)計學分析 使用SPSS 23.0統(tǒng)計學軟件對實驗所得數(shù)據(jù)進行分析,采用單因素方差分析方法。正態(tài)分布計量資料采用均數(shù)±標準差表示。檢驗水準取α=0.05,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 AP肺損傷DEGs篩選結果及相關通路分析 本研究從GSE121038數(shù)據(jù)集中篩選到相關DEGs 809個（上調基因562個,下調基因247個）。從GSE48787數(shù)據(jù)集中篩選到相關DEGs 613個（上調基因319個,下調基因294個）。將兩個數(shù)據(jù)集的上調基因和下調基因分別取交集,共獲得54個DEGs （上調基因40個,下調基因14個）。火山圖見圖1。在KEGG數(shù)據(jù)庫中,分析結果顯示DEGs主要集中在Toll樣受體、TNF-α、HIF-1等信號通路且以上調基因為主,提示ALI發(fā)病過程中這些通路可能被異常激活。見圖1～4。

3.2 血清AMY活性檢測結果 ELISA檢測結果顯示,造模后6 h及24 h AP組及血必凈注射液組血清AMY活性顯著高于假手術組,但在24 h血必凈注射液組AMY活性低于AP組,提示血必凈注射液對重癥AP肺損傷可能有一定治療作用,但需聯(lián)用其他藥物以加強療效。結果見表1。

表1 血必凈對AP大鼠血清AMY活性的影響（n=8，）

表1 血必凈對AP大鼠血清AMY活性的影響（n=8，）

注：與假手術組比較,△P＜0.05,△△P＜0.01；與AP模型組比較,*P＜0.05。

3.3 血必凈對AP大鼠胰腺及肺臟組織病理學的影響 胰腺組織切片HE染色鏡下觀察顯示假手術組胰腺結構完整清晰,無胰腺腺葉崩解破壞,未見有炎癥細胞浸潤。造模后6 h時AP模型組大鼠胰腺腺葉出現(xiàn)崩解破壞,有炎癥細胞浸潤,24 h時炎癥細胞浸潤增多；血必凈注射液組胰腺結構與假手術組不同,也可見胰腺腺葉損壞、炎癥細胞浸潤等情況,但其病損程度與AP模型組比較明顯好轉,見圖5。肺組織切片HE染色鏡下觀察顯示假手術組肺組織結構完整,肺泡腔清晰,肺泡內未見炎癥細胞及水腫。造模后6 h時AP模型組肺組織出現(xiàn)破壞,結構不完整,肺泡腔內出現(xiàn)炎癥細胞浸潤及水腫并可見到肺間質充血水腫及增厚,24 h時炎癥細胞略有增多。血必凈注射液組6 h和24 h也有一定程度病理改變,但較AP模型組減輕,見圖6。

圖1 GSE121038和GSE48787數(shù)據(jù)集DEGs火山圖

圖2 Toll樣受體信號通路

圖3 TNF信號通路

圖4 HIF信號通路

3.4 血必凈對AP大鼠肺臟TLR4、NF-κB、TNF-α 表達水平的影響 ELISA檢測結果顯示,在造模后6 h,與假手術組比較,AP模型組大鼠肺臟TLR4、NF-κB、TNF-α 表達水平顯著升高。血必凈注射液組大鼠TLR4、NF-κB、TNF-α表達水平也顯著升高,比AP模型組有降低趨勢但無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）,見表2。造模后24 h,AP模型組大鼠肺臟TLR4、NF-κB、TNF-α 表達水平進一步升高,血必凈注射液組大鼠TLR4、NF-κB、TNF-α 表達水平較AP模型組有所下調,其中以TNF-α 表達水平下降最為顯著（P＜0.01）,見表3。

表2 造模后6 h肺臟TLR4、NF-κB、TNF-α 表達水平（n=8，）

表2 造模后6 h肺臟TLR4、NF-κB、TNF-α 表達水平（n=8，）

注：與假手術組比較,△P＜0.05,△△P＜0.01。

表3 造模后24 h肺臟TLR4、NF-κB、TNF-α 表達水平（n=8，）

表3 造模后24 h肺臟TLR4、NF-κB、TNF-α 表達水平（n=8，）

注：與假手術組比較,△P＜0.05,△△P＜0.01；與AP模型組比較,*P＜0.05,**P＜0.01。

4 討論

AP是一種臨床常見的外科急腹癥,主要病因是膽道疾病和酒精,但近年來高脂血癥繼發(fā)的胰腺炎比例也越來越高［11］。此外,自身免疫性胰腺炎、藥物性胰腺炎也開始普遍受到關注［12］。AP主要特征是全身炎癥和胰腺壞死/凋亡［13］。目前研究認為AP發(fā)病機制的關鍵就是體內促炎反應與抗炎反應的失衡,大量炎癥因子不僅損害胰腺而且可以損傷胰腺以外的遠隔臟器,如肺臟、肝臟、腎臟腺等。其中以ALI最為突出,并且可以演變成為呼吸衰竭,是胰腺炎引起死亡的主要原因［14］。因此,不斷深入研究SAP引發(fā)ALI的發(fā)病機制和治療方法是醫(yī)學領域研究的重要課題。

圖5 血必凈注射液對AP大鼠胰腺病理形態(tài)改變的影響（HE×400）

圖6 血必凈注射液對AP大鼠肺臟病理形態(tài)改變的影響（HE×400）

GEO數(shù)據(jù)庫是由美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information,NCBI）開發(fā)并維護的一個基因表達數(shù)據(jù)倉庫和在線資源,收錄了世界各國研究機構及研究者提交的各種高通量數(shù)據(jù),是生物信息學研究分析的重要數(shù)據(jù)來源,對于疾病發(fā)病機制的研究、潛在靶點的篩選提供了重要信息［15-16］。本研究從GEO高通量數(shù)據(jù)庫中篩選AP及ALI樣本和正常對照樣本之間具有差異表達的基因,共篩選出的54個主要參與促進炎癥反應、IL-1及TNF介導的細胞反應、凋亡過程、中性粒細胞趨化過程等,并且富集在HIF-1信號通路、TNF信號通路、趨化因子信號通路、PI3K-Akt （磷脂酰肌醇三激酶-蛋白激酶B）等信號通路。其中,TNF信號通路是典型的炎癥反應相關通路。已有大量研究證實AP引發(fā)的ALI主要就是由于炎性介質和細胞因子如IL-1β、TNF-α 大量釋放所致［17］,且TLR4/NF-κB信號通路處于激活狀態(tài)［18］,TLR-4可介導NF-κB的活化,從而誘導產生大量炎癥因子如IL-1β、TNF-α、IL-6等,這些炎癥因子又可以激活TLR4/NF-κB通路,進而引起炎癥“瀑布式反應”。

AP并發(fā)ALI發(fā)病機制復雜,單一的抗炎藥物難以取得良好的療效。血必凈注射液由當歸、紅花、川芎、赤芍、丹參5味中藥組成,具有多成分多靶點的作用特點［19］,主要用于膿毒癥治療,其作用機制主要是通過抑制炎癥因子的產生［20］,此外還與抗內毒素、抑制炎癥、恢復凝血和免疫功能調節(jié)有關［21-22］。血必凈注射液在臨床使用時給藥途徑為靜脈注射,但在動物實驗中考慮到大鼠尾靜脈較細,注射時藥物易滲漏于周圍組織影響實驗結果,有研究表明腹腔注射可代替尾靜脈注射［23］,所以一些動物實驗中以大鼠腹腔注射方式給予血必凈治療［24-25］。根據(jù)血必凈注射液臨床每日使用劑量,結合大鼠與人藥物劑量折算系數(shù)6.25［26］及本研究中的給藥間隔時間,故而計算出大鼠腹腔注射給藥劑量為4 mL/kg,也見其他研究給予大鼠腹腔注射4 mL/kg血必凈注射液進行治療［27-28］。本研究利用常見的胰腺被膜下注射5% 牛磺膽酸鈉的方法制備AP大鼠模型［29］,分別利用血清AMY含有量和肺組織病理學改變、TLR4/NF-κB信號通路關鍵分子TLR4、NF-κB、TNF-α 的表達水平初步觀察血必凈注射液對于AP大鼠ALI的保護作用及可能機制,結果表明血必凈注射液可能通過抑制TLR4/NF-κB炎癥信號通路發(fā)揮一定的治療效果。

綜上所述,本研究利用生物信息篩選AP并發(fā)ALI的相關靶點及富集的信號通路,同時觀察血必凈注射液對AP并發(fā)ALI模型大鼠的治療作用及可能機制,以期為該病機制的深入研究及血必凈注射液作用機制的探討提供依據(jù)。