基于HPLC-Q-TOF/MS法的鬼針草血清藥物化學探究

王宇卿，李淑嬌，莊 果

（南陽醫學高等專科學校科研中心，河南南陽 473061）

鬼針草Bidens bipinnataL.又名鬼骨針、婆婆針,為菊科鬼針草屬一年生草本植物,全草可作藥用。鬼針草屬的藥材資源非常豐富,全球約有230余種,廣布于亞洲、美洲的亞熱帶地區,在我國有9個種和2個變種,遍布全國各地,極易采集［1］。《本草拾遺》 記載鬼針草味苦,性平,無毒,具有清熱解毒、祛風除濕、活血散瘀等作用,可用于痰濕瘀阻等癥；《中藥大詞典》 中記載鬼針草味苦,性微寒,歸肝、肺、胃、大腸經,具有清熱解毒、散瘀消腫的功效；《中華本草》 功效分類為清熱解毒藥、消腫藥,具有清熱解毒、散瘀消腫等功效［2］。現代藥理研究表明,鬼針草具有抗炎、抗氧化、抗高血壓、抗高血脂和血栓形成、抑菌、免疫調節等作用［3-7］,現代臨床可用于治療腹瀉、痢疾、心血管系統疾病、原發性高血壓等［8-10］。目前,關于該藥體內活性成分方面的研究鮮有報道,本實驗首次聯合采用HPLC-Q-TOF/MS技術與中藥血清藥物化學的相關理論和研究方法對鬼針草進行研究,旨在探求該中藥發揮藥效的物質基礎,為鬼針草的進一步研究開發奠定基礎。

1 材料

1.1 儀器 1260高效液相色譜系統、G6530 Q-TOF/MS質譜儀（美國安捷倫公司）；Milli Q超純水機（美國密理博公司）；XS-105分析天平［梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司］；TGL-16G高速冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠）；WH-3微型渦旋混合儀（上海滬西分析儀器有限公司）；DZF-6020真空干燥箱（上海新苗醫療器械制造有限公司）。

1.2 試劑與藥物 鬼針草飲片（批號 161015；產地河南南陽）購于淅川縣度幫中藥材種植專業合作社,經南陽醫學高等專科學校王宇卿副教授鑒定為菊科鬼針草屬一年生草本植物鬼針草Bidens bipinnataL.的地上部分。沒食子酸（Y19M8C36143）、原兒茶酸 （Z30M6L1）、金絲桃苷（Y05J8X39277）、木樨草苷 （Y05D8H49919）、木樨草素（C24M8Q36543）,均購于上海源葉生物科技有限公司；綠原酸 （110753-200413）、蘆丁 （0080-9504）、槲皮素（100081-201509）,均購于中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純（美國Fisher公司）；超純水自制；其他試劑均為分析純。

1.3 實驗動物 清潔級雄性SD大鼠,體質量180～220 g,購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司,合格證號SCXK（湘）2013-0004。

2 方法

2.1 供試品溶液制備 稱取鬼針草500 g,用10倍量的水進行2次加熱回流提取,每次各2 h,自然冷卻后,傾出水溶液,過濾藥渣,合并2次水提液進行真空減壓濃縮至1.5 g生藥/g浸膏,制得鬼針草樣品,冷藏備用。

2.2 對照品溶液制備 分別精密稱量各對照品置于10 mL量瓶中,加70%甲醇充分溶解后定容,制成適宜濃度的混合對照品溶液,經0.22 μm微孔濾膜過濾,即得。

2.3 空白血清及含藥血清制備 取雄性SD大鼠12只,禁食12 h （自由飲水）,稱定質量,隨機分為2組,每組6只。空白組灌胃給予蒸餾水,給藥組灌胃給予鬼針草（10 g生藥/kg）水提液,每日早晚各1次,連續給藥3 d；末次給藥后60 min眼眶靜脈叢取血0.5 mL,室溫放置30 min后,3 000 r/min條件下離心10 min,取上清液血清0.2 mL,加入3倍量乙腈,渦旋混勻30 s,靜置片刻后13 000 r/min離心10 min,取上清,于真空干燥箱濃縮至干后用100 μL 70%乙腈-水復溶,渦旋,13 000 r/min高速離心10 min,取上清液作為血清供試品。

2.4 分析條件 Poroshell 120 EC-C18色譜柱 （3 mm×150 mm,2.7 μm）；流動相乙腈（A）-0.2% 甲酸（B）,梯度洗脫（0～1 min,5%～15% A；1～7 min,15%～25% A；7～11 min,25%～40% A；11～14 min,40%～50% A；14～15 min,50%～100% A；15～20 min,100% A；20～21 min,100%～5%A）；體積流量0.5 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量5 μL。

G6530A Q-TOF/MS質譜儀；AJS ESI源；ESI+、ESI模式；干燥氣體溫度320 ℃；干燥氣體體積流量8 L/min；霧化器壓力40 psi （1 psi=6.895 kPa）；鞘氣溫度300 ℃；鞘氣體積流量12 L/min；碎裂電壓175 V；毛細管電壓3.5 kV；正負離子采集范圍m/z100～1 700。

2.5 鬼針草及其血清中成分分析 取3批鬼針草水煎液,以及6批鬼針草血清樣品在相同的色譜和質譜條件下進行HPLC-Q-TOF/MS分析,建立其指紋圖譜,比較分析確定入血成分。然后參照有關文獻、對照品對照及其一級、二級質譜信息初步鑒定鬼針草的入血成分。

3 結果

在鬼針草含藥血清樣本中共檢測出11種移行成分,見圖1。通過HPLC-Q-TOF/MS檢測,并經過與對照品、文獻相關數據對比,初步鑒定出11種移行成分,其中有機酸類5種、黃酮類5種及聚炔類1種,各化合物相關質譜信息見表1。

圖1 各樣品總離子流圖

表1 鬼針草血中11種移行成分

3.1 有機酸類化合物結構解析 共鑒定出有機酸類化合物5個,分別為化合物1～5。化合物1,保留時間2.412 min,在負離子模式下,一級全掃描質譜分析中其準分子離子為m/z169.014 6,進一步進行二級全掃描質譜分析,其主要的碎片離子m/z151.003 0、125.023 6分別為準分子離子失去H2O和CO2后的碎片；在正離子模式下,其準分子離子為m/z171.029 1,主要碎片離子m/z127.039 5為準分子離子失去CO2后的碎片,然后與文獻及對照品對照,鑒定為沒食子酸［11］。化合物2,保留時間2.503 min,在負離子模式下,一級全掃描質譜分析中其準分子離子為m/z153.019 6,進一步進行二級全掃描質譜分析,其主要的碎片離子有m/z109.029 4 ［M-H-CO2］-、108.021 1 ［M-HCHO2］-；在正離子模式下,其準分子離子為 m/z155.034 1,主要碎片離子m/z111.044 6為準分子離子失去CO2后的碎片,然后與文獻及對照品對照,鑒定為原兒茶酸［12］。化合物3,保留時間3.657 min,在負離子模式下,一級全掃描質譜分析中其準分子離子為 m/z353.087 4,進一步進行二級全掃描質譜分析,其主要的碎片離子有m/z179.034 4 ［M-H-C7H10O5］-、135.044 6 ［MH-C7H10O5-CO2］-；在正離子模式下,其準分子離子為m/z355.102 6,主要碎片離子m/z181.050 1為準分子離子失去C7H10O5后的碎片,然后與文獻及對照品對照,鑒定為綠原酸［13］。化合物4～5在ESI+模式下均得到m/z517［M+H］+且根據精確質量數計算得分子式均為C25H24O12,峰4碎片離子m/z353.087 6 ［M-H-C9H8O4］-、191.055 8［M-H-C18H16O8］-、179.034 3 ［M-H-C16H18O9］-、355.103 1 ［M+H-C9H7O3］+,峰5碎片離子m/z353.087 5 ［M-HC9H8O4］-、191.055 4 ［M-H-C18H16O8］-、179.034 1 ［MH-C16H18O9］-、355.102 7 ［M+H-C9H7O3］+、163.039 5［M+H-C16H17O9］+,結合文獻［14-17］推測峰4為3,4-二咖啡酰基奎寧酸,峰5為3,5-二咖啡酰基奎寧酸,其保留時間分別為6.156、6.223 min。

圖2 黃酮類化合物特征碎裂途徑

3.2 黃酮類化合物結構解析 共鑒定出黃酮類化合物5個,分別為化合物6～8、10～11,此類化合物的特征碎裂途徑見圖2。化合物6,保留時間為6.816 min,在負離子模式下,一級全掃描質譜分析中其準分子離子為m/z609.145 7,進一步進行二級全掃描質譜分析,其主要的碎片離子有m/z463.087 8 ［M-H-C6H10O4］-、301.034 4 ［MH-C13H22O9］-、193.013 4 ［M-H-C13H22O9-B］-、107.013 50,4A-；在正離子模式下,一級全掃描質譜分析中其準分子離子為m/z611.160 6,進一步進行二級全掃描質譜分析,其主要的碎片離子為m/z303.050 7 ［M+H-C12H20O9］+,結合文獻［18-19］推測為蘆丁。化合物7,保留時間7.655 min,在負離子模式下,進行一級全掃描質譜掃描,與空白血清比較,灌胃給藥后的大鼠血清樣品中檢測到金絲桃苷原形的準分子離子峰m/z463.087 6,然后進行二級質譜掃描,其主要的碎片離子有m/z301.034 9、257.045 2、107.013 3,這些碎片為準分子離子峰分別失去C6H12O6、C6H12O6+CO2、0,4B-形成的；在正離子模式下發現其準分子離子峰m/z465.103 1及碎片離子m/z303.050 3 ［M+H-C6H12O6］+,然后通過與文獻及對照品對照,鑒定為金絲桃苷［20］。化合物8,保留時間7.853 min,在負離子模式下進行一級全掃描質譜掃描,與空白血清比較,灌胃給藥后的大鼠血清樣品中檢測到木樨草苷原形的準分子離子峰m/z447.092 5,然后進行二級質譜掃描,其主要的碎片離子有m/z285.039 7 ［M-H-C6H12O6］-、267.029 1 ［M-H-H2O］-、217.049 8 ［M-H-C3O2］-；在正離子模式下發現其準分子離子峰m/z449.108 2及碎片離子m/z287.055 4 ［M+H-C6H12O6］+,然后通過與文獻及對照品對照,鑒定為木樨草苷［21］。化合物10,保留時間13.934 min,在負離子模式下進行一級全掃描質譜掃描,與空白血清比較,灌胃給藥后的大鼠血清樣品中檢測到木樨草素原形的準分子離子峰m/z285.040 1,然后進行二級質譜掃描,其主要的碎片離子m/z267.029 1、241.050 3、217.049 8為準分子離子分別失去H2O、CO2、C3O2后形成的；在正離子模式下發現其準分子離子峰m/z287.055 3,碎片離子m/z269.045 2為準分子離子失去一分子H2O后形成的,然后通過與文獻及對照品對照,鑒定為木樨草素［23］。化合物11,保留時間14.127 min,在負離子模式下進行一級全掃描質譜掃描,與空白血清比較,灌胃給藥后的大鼠血清樣品中檢測到槲皮素原形的準分子離子峰m/z301.035 1,然后進行二級質譜掃描,其主要的碎片離子m/z257.045 4 ［M-H-CO2］-、193.013 3 ［M-H-B］-為準分子離子分別失去CO2、B環后形成的；在正離子模式下發現其準分子離子峰m/z303.050 3,碎片離子m/z275.055 3、259.060 8為準分子離子峰分別失去CO和CO2后形成的,然后通過與文獻及對照品對照,鑒定為槲皮素［23］。

3.3 聚炔類化合物結構解析 化合物9,保留時間8.982 min,在負離子模式下,檢測到其主要碎片有m/z423.129 6 ［M+HCOO］-、377.124 1 ［M-H］-,在正離子模式下,檢測到其主要碎片有379.139 6 ［M+H］+、401.121 5［M+Na］+、217.087 1 ［M+H-C6H12O6］+、181.071 2［M+H-C13H12O3］+,然后結合文獻及鬼針聚炔苷的精確分子量,初步推測為鬼針聚炔苷［22］。

4 討論

本實驗首次運用HPLC-Q-TOF/MS技術結合中藥血清藥物化學的相關理論和研究方法對鬼針草的體內活性成分進行研究,初步分析了鬼針草的入血成分。本實驗分別采用水浴法、高氯酸法、甲醇沉淀法和乙腈沉淀法對血清樣品進行處理,結果發現乙腈沉淀法得到的樣品色譜圖信息量較大,干擾少,最終確定采用乙腈沉淀法對血清樣品進行處理。

本研究通過對比鬼針草水煎液、含藥血清、空白血清以及對照品等指紋圖譜,利用Qualitative Analysis等軟件進行分析,根據質譜信息、保留時間、精確相對分子量及與文獻和對照品對比,共鑒定出11種原型入血成分。鬼針草中入血成分主要是黃酮類、聚炔類、有機酸類等。這些成分都具有抗菌、抗炎、降血脂、降血壓、清除自由基等作用［8,24-25］。這進一步證實了上述入血成分可能為鬼針草在體內發揮藥效的有效組分群,以期為其后續研究開發提供驗依據,也為闡明鬼針草藥效物質基礎提供參考。