柳州地區(qū)15 個常用STR 基因座的遺傳多態(tài)性及突變分析

許澤輝 羅世強(qiáng) 唐寧 王秋華 鐘青燕 袁德健 蔡稔 崖嬌練 嚴(yán)提珍（通訊作者）

（柳州市出生缺陷預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室柳州市婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳科 廣西 柳州 545001）

短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeat，STR）是由2 ～6個核苷酸組成并存在于真核生物基因組中的DNA 串聯(lián)重復(fù)序列，具有高度多態(tài)性和孟德爾共顯性遺傳規(guī)律的特性，是目前廣泛應(yīng)用于法醫(yī)物證學(xué)檢驗(yàn)的多態(tài)性遺傳標(biāo)記。而相應(yīng)開發(fā)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-短串聯(lián)重復(fù)（polymerase chain reaction-short tandem repeat，PCR-STR）檢測技術(shù)是國際法醫(yī)學(xué)界一項(xiàng)技術(shù)手段。AmpFLSTR ? Identifiler ? Plus 試劑盒在目前的親子鑒定實(shí)踐中得到了較廣泛地應(yīng)用，它是采用五色熒光技術(shù)檢測15個STR 基因座和一個性別位點(diǎn)。雖然STR 基因座具有高度的遺傳穩(wěn)定性，但物種的發(fā)展同樣不可避免發(fā)生突變。在親子鑒定中STR 基因座發(fā)生突變的現(xiàn)象近幾年均有報道[1-4]。本文作者通過親子鑒定案例回顧性分析，對AmpFLSTR ? Identifiler ? Plus 試劑盒15 個STR 位點(diǎn)進(jìn)行觀察，分析了本地區(qū)STR 基因座的突變情況，為今后的親子鑒定提供頻率計(jì)算的基礎(chǔ)。現(xiàn)報道如下。

1.資料與方法

1.1 樣本材料

2013 年3 月—2017 年10 月7450 例來源于實(shí)驗(yàn)室日常檢案且結(jié)論為肯定親權(quán)關(guān)系的家系樣本，其中三聯(lián)體家系2319 例，二聯(lián)體家系5131 例，樣本類型有血濾紙、帶毛囊毛發(fā)、羊水、絨毛等。

1.2 DNA 提取

采用Chelex-100 法提取樣本基因組DNA。

1.3 基因分型

常規(guī)采用AmpFLSTR ? Identifiler ? Plus 試劑盒（美國life 公司）對基因組DNA 直接PCR 復(fù)合擴(kuò)增，若出現(xiàn)疑似突變現(xiàn)象，二聯(lián)體父女或母女，二聯(lián)體父子或母子，三聯(lián)體分別采用X-STR、Y-STR、PowerPlex24 等進(jìn)一步驗(yàn)證。擴(kuò)增產(chǎn)物使用ABI3500Dx 遺傳分析儀（美國life 公司）按相應(yīng)儀器使用說明書進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物片段分析，應(yīng)用GeneMapper ID-X v1.4 軟件進(jìn)行基因分型分析。

1.4 突變基因座、來源、步數(shù)的確定

用AmpFLSTR ? Identifiler ? Plus 體系進(jìn)行檢測，若基因座上遺傳位點(diǎn)有1 ～2 個違反遺傳規(guī)律，參照“親權(quán)鑒定實(shí)驗(yàn)室規(guī)范及技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)建議”計(jì)算累計(jì)親權(quán)指數(shù)（paternity index，PI）、增加X-STR 或Y-STR 檢測[5]。若累計(jì)PI ＞10000，且X-STR 或Y-STR 符合遺傳規(guī)律，則判定有親權(quán)關(guān)系，違反遺傳規(guī)律的基因座則視為突變位點(diǎn)。突變等位基因來源的確定[6]，將子代發(fā)生突變等位基因座與其親代父方或母方的等位基因相差最小步數(shù)的等位基因視為突變等位基因來源方；突變等位基因座的增加或減少的多少為突變步數(shù)，若同時存在同步數(shù)的增加或減少可能，則視為不確定來源方，本研究增加或減少一步突變以+1、-1 表示，增加或減少二步突變以+2、-2表示，依次類推。若突變?yōu)榧兒献樱懦龣z測試劑盒的原因而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)錯誤。

1.5 統(tǒng)計(jì)及分析

根據(jù)STR 基因座突變率的計(jì)算公式：STR 基因座的突變率=突變STR 基因座數(shù)/（雙親案例數(shù)×2+單親案例數(shù)）來計(jì)算每個STR 基因座突變率，由直接計(jì)數(shù)法得出具有STR 基因座突變的案例數(shù)，并分析相關(guān)影響因素。并使用χ2檢驗(yàn)，來評估各統(tǒng)計(jì)量是否存在顯著差異。

2.結(jié)果

2.1 STR 基因座突變分析結(jié)果

統(tǒng)計(jì)7450 例判定為親子關(guān)系的案例，三聯(lián)體親子鑒定有2319 例案例，單親二聯(lián)體親子鑒定有5131 例案例，共觀察到9769 次減數(shù)分裂。在15 個檢測基因位點(diǎn)中觀察到一個STR 位點(diǎn)突變有109 例案例，突變位點(diǎn)涉及到13 個基 因 座（D8S1179、D21S11、D7S820、CSF1P O、D3S1358、D13S317、D16S539、D2S1338、D19S433、vWA、D18S51、D5S818 和FGA），其中以FGA 基因座的突變率最高（1.84‰），突變率最低基因座為D2S1338，該所有檢測基因座中僅T H01和TPOX 沒有檢測到突變情況，其余都檢測到有突變情況。根據(jù)文獻(xiàn)分別對觀察到的109 例突變率進(jìn)行計(jì)算[7-8]，STR 基因座突變率見表1。

表1 STR 基因座突變率匯總

2.2 STR 基因座突變步數(shù)

觀察并比較同一家系突變基因座的等位基因型，STR基因座突變步數(shù)情況見表2。三聯(lián)體突變有34 個案例，二聯(lián)體突變75 個案例，其中一步突變101 次（92.66%），二步突變1 次（0.92%），三步突變4 次（3.67%），四步突變3 次（2.75%）。

表2 STR 基因座突變步數(shù)情況

2.3 突變等位基因來源

109 個案例中檢測到突變等位基因座來自父源的有98 例，占突變基因座的89.91%，來自母源的9 例，占突變基因座的8.26%，無法確定來源2 例，占突變基因座的1.83%。父源突變率與母源突變率比例為98：9，約10：1（χ2=74.02，P＜0.01）。見表3。

表3 STR 基因座突變來源匯總

3.討論

3.1 STR 基因位點(diǎn)的突變頻率分析

基因突變一般是DNA 在復(fù)制過程中，DNA 聚合酶滑動造成子代重復(fù)序列中核心序列的改變引起的。本研究通過對柳州地區(qū)7450 例親子鑒定案例的分析，發(fā)現(xiàn)109 例案例的基因座有突變發(fā)生，突變率在0 ～1.84‰之間。分析顯示FGA 基因座突變率較高，其次是D8S1179、D18S51、D19S433、vWA。突變頻率最高的FGA 基因座所占突變案例比例為1.84‰，與文獻(xiàn)報道的FGA 基因座突變率最高一致[9]，分析認(rèn)為本地區(qū)少數(shù)民族人口比例多，不同地區(qū)人群突變存在差異性。這表明不斷累積不同地區(qū)人群的突變數(shù)據(jù)并共享數(shù)據(jù)，可以更好地為法醫(yī)學(xué)親子鑒定服務(wù)。據(jù)李成濤等[10]分析認(rèn)為STR 基因座核心序列重復(fù)次數(shù)越多，其基因突變率相對越高，本研究15 個基因位點(diǎn)中基因突變率最高的FGA 其重復(fù)范圍高達(dá)12.2 ～51.2。相對于等位基因重復(fù)范圍較小的基因座TH01 和TPOX，在本次沒有發(fā)現(xiàn)突變現(xiàn)象，也證明了等位基因范圍越小，突變率越低，所以在親子鑒定選取STR 位點(diǎn)時應(yīng)將突變頻率和人群特異性的因素考慮在內(nèi)。

3.2 STR 基因位點(diǎn)的突變模式分析

在本次109 例突變案例中，一步突變101 例，占92.66%；二步只有1 例，占0.92%；三步突變3 例，占3.67%；四步突變4 例，占2.75%。未發(fā)現(xiàn)有五步或更多突變情況。同時發(fā)現(xiàn)一步突變?yōu)橹饕耐蛔冃问剑揭陨系耐蛔儯l(fā)生突變的子代或親代基因座都為純合子，且僅出現(xiàn)在D8S1179 基因座等位基因。本次使用不同試劑盒檢測驗(yàn)證，但沒有進(jìn)行基因測序，不可以排除基因座丟失的可能性。對D8S1179、D18S51 等位基因出現(xiàn)不符合遺傳規(guī)律的現(xiàn)象，且基因座為純合子時，要特別注意，需進(jìn)一步進(jìn)行分析驗(yàn)證。

3.3 STR 基因位點(diǎn)突變的性別差異

根據(jù)多位學(xué)者報道[1-4]，基因座突變來源主要是來自父源，母源突變比例較低。本次來自父源的突變例數(shù)所占突變例數(shù)高達(dá)98 例，占89.91%，母源9 例，不確定例數(shù)為2 例，父源所占比與母源所占比的比例約為10 ∶1，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與其他報道的比例相近[1-4，8，9]。一般認(rèn)為，父源突變率與母源突變率不同的因素，主要是減數(shù)分裂次數(shù)越多，產(chǎn)生變異概率越大。本次主要人群以二聯(lián)體為主，且是父子二聯(lián)體為主，表現(xiàn)為父源性突變率比例明顯偏高，與邱平明等[9]報道一致。同時，排除近親，追加父方或母方樣品檢測，降低誤判風(fēng)險[9]。

綜上，無論對三聯(lián)體還是二聯(lián)體，特別是父子二聯(lián)體進(jìn)行親子鑒定時，注意突變現(xiàn)象的存在，尤其注意純合子及多步突變，而且選取突變率低，穩(wěn)定的基因座進(jìn)行檢測，配套其他遺傳標(biāo)記試劑相互認(rèn)證，按各基因座突變率計(jì)算親權(quán)指數(shù)，累積更多不同地區(qū)人群的突變數(shù)據(jù)，提高親子鑒定結(jié)論判定的準(zhǔn)確性。