血清HBV RNA定量在指導慢性乙型肝炎抗病毒治療過程中的作用

卞丹丹， 鄭素軍

1 首都醫科大學電力教學醫院 感染性疾病科， 北京 100073； 2 首都醫科大學附屬北京佑安醫院 疑難肝病與人工肝中心， 北京 100069； 3 肝衰竭與人工肝治療研究北京市重點實驗室， 北京 100069

1 HBV RNA的形成

在HBV感染過程中，HBV病毒粒子通過與肝細胞受體牛磺膽酸鈉協同轉運多肽結合，將含有病毒松弛環狀DNA(rcDNA)的核衣殼釋放到肝細胞，HBV核心顆粒包含的rcDNA通過一系列機制被運輸到細胞核，在細胞核中依賴HBV編碼的DNA聚合酶補齊兩條鏈上的缺口，最后形成HBV cccDNA[1]。cccDNA作為病毒轉錄的模板，可利用宿主細胞的RNA聚合酶進行轉錄，產生4種不同的RNA(3.5、2.4、2.1、0.7 kb)，其中3.5 kb的mRNA有兩種：前核心區RNA(PreC RNA)和前基因組RNA(pgRNA)，PreC RNA用于編碼HBeAg，pgRNA是新病毒逆轉錄及翻譯HBV聚合酶和核心蛋白的模板[2-3]。在衣殼內，聚合酶通過反轉錄將pgRNA轉化為rcDNA，然后與病毒蛋白裝配成新的完整HBV釋放到細胞外，或再進入細胞核補充cccDNA池[4]。有研究[2]證實，HBV感染者血清中的HBV RNA為pgRNA，其來源可能為核衣殼包裹的pgRNA在未啟動逆轉錄的情況下，直接獲得包膜并從感染的肝細胞中釋放出來，被稱為“HBV RNA病毒樣顆粒”。

2 血清HBV RNA與肝臟組織內cccDNA狀態的關系

由于肝組織內HBV cccDNA的檢測需要做肝組織活檢，多數患者不愿意接受，在臨床應用中存在較大的困難[5-7]。HBV pgRNA作為HBV cccDNA的直接轉錄產物，理論上HBV RNA水平能夠反映肝細胞內cccDNA的水平及轉錄活性。

多項臨床及基礎研究顯示，外周血清中的HBV RNA水平與肝組織內HBV cccDNA密切相關。Wang等[8]對62例HBeAg陽性和22例HBeAg陰性初治患者研究發現，HBeAg陽性患者的血清HBV RNA定量與肝內cccDNA水平相關性良好，而HBeAg陰性患者的血清HBV RNA與肝內cccDNA無相關性。該研究進一步對41例經核苷(酸)類似物(NAs)治療2年以上的慢性乙型肝炎(CHB)患者進行了調查。其中，20例患者血清HBV RNA和肝內cccDNA均陽性，9例血清HBV RNA和肝內cccDNA均低于檢測下限，12例肝內cccDNA陽性，但血清HBV RNA低于檢測下限。分析提示血清HBV RNA與肝內cccDNA的存在與否及轉錄活性密切相關。另有一項針對47例使用恩替卡韋長期抗病毒治療且血清HBV RNA檢測不到患者的研究[9]也證實，血清HBV RNA水平與肝內HBV RNA水平(r=0.725，P<0.001)及肝內HBV RNA/cccDNA比值(r=0.584，P=0.001)密切相關，這些數據表明，血清HBV RNA水平反映了肝內HBV RNA數量和cccDNA的HBV轉錄活性。Giersch等[10]對HBV感染小鼠模型血清pgRNA與肝內pgRNA和cccDNA的研究發現，未經治療的HBV感染小鼠血清pgRNA水平與肝組織內cccDNA水平顯著相關，而用PEG-IFNα治療后的小鼠血清pgRNA與cccDNA無相關性。有研究者[11]分析認為可能是PEG-IFNα對cccDNA轉錄翻譯的表觀遺傳修飾降低了cccDNA的活性但不顯著影響cccDNA載量，并且PEG-IFNα可加速pgRNA降解或抑制其合成以降低HBV RNA水平，從而導致血清HBV RNA與cccDNA無相關性[12-13]。由上可知，不同HBeAg狀態、不同抗病毒藥物等因素均會影響循環HBV RNA的水平，因此，血清HBV RNA作為肝細胞內cccDNA轉錄活性替代標志物的臨床適用性尚待進一步研究。

3 血清HBV RNA水平與肝組織學活性指標的關系及預測價值

Wang等[9]研究指出HBV RNA的積累和低水平的病毒復制可能導致肝病進展，該研究發現，血清HBV RNA水平與壞死性炎癥和纖維化組織病理學評分密切相關(Metavir炎癥分級：r=0.665，P<0.001；Metavir纖維化分期：r=0.722，P<0.001)。肝內HBV RNA水平也觀察到類似結果。在NAs治療期間，血清HBV RNA水平在2.45 log10拷貝/ml時對區分輕度(Metavir評分<2分)和重度(Metavir評分≥2分)肝組織病理學的準確性最高。這些數據表明，在接受長期NAs治療的患者中，HBV RNA水平與肝病進展存在關聯。并且該研究通過原位雜交的方法觀察到HBV RNA嚴格分布在肝細胞的細胞質中，HBV RNA陽性的肝細胞呈灶狀聚集，零星分布于肝小葉，與HBsAg共定位。提示即使在長期恩替卡韋治療后，病毒轉錄活性在肝臟的某些解剖部位仍持續存在。

4 CHB患者抗病毒治療過程中血清HBV RNA水平在病毒學應答中的預測作用

多數研究表明，血清HBV RNA可作為監測抗病毒治療效果的有用指標。Huang等[14]一項針對52例CHB患者接受NAs(拉米夫定26例，恩替卡韋26例)抗病毒治療的研究發現，與血清HBV DNA水平從可檢測到不可檢測時間間隔≥16周的CHB患者相比，間隔<16周的患者在治療第12周時血清HBV RNA水平顯著降低。血清HBV RNA是此類患者最初病毒學反應(HBV DNA首次小于檢測值下限)的唯一獨立治療預測因子。印度的一項研究[15]對91例HBeAg陰性CHB患者的血清樣本進行了回顧性分析，這些患者曾單獨應用PEG-IFN或聯合恩替卡韋抗病毒治療48周，在治療后3年的隨訪中，維持病毒學應答率(定義為持續HBV DNA<2000 IU/ml)和HBsAg清除率分別為37.4%(34/91)和7.7%(7/91)。治療前血清低水平的HBV RNA和HBsAg與維持病毒學應答獨立相關。由此提出在PEG-IFN治療前HBV RNA水平可以預測獲得維持病毒學應答的高概率患者，有助于個體化決策。

對于HBeAg陽性患者，無論是自發還是治療誘導的血清學轉換，都被認為是HBsAg丟失或血清轉換的先決條件。血清HBV RNA水平可作為NAs治療過程中HBeAg血清轉換的早期預測指標。van B?mmel等[16]在對50例接受富馬酸替諾福韋酯或拉米夫定治療的HBeAg陽性患者的研究中指出，治療過程中患者血清HBV RNA水平的變化與有無發生HBeAg血清學轉換密切相關。與未發生HBeAg血清學轉換的患者相比，發生血清學轉換患者治療過程中HBV RNA水平下降更快。多因素分析顯示，與HBV RNA、HBsAg、ALT、HBV基因型、年齡和性別相比，治療第3個月和第6個月HBV RNA水平下降是HBeAg血清轉換的最強預測因子。Luo等[17]對98例應用NAs抗病毒治療長達7年的CHB患者進行研究，logistic回歸模型顯示治療48周后HBV RNA陽性是HBeAg未清除的危險因素(風險比=6.69)，并且在NAs長期抗病毒治療過程中，血清HBV RNA陽性患者也需要更多的時間來達到HBeAg清除。因此，治療48周后HBV RNA陽性患者更難達到治療終點，這些患者在治療過程中亦會產生更大的經濟壓力。

由于NAs與IFN抗病毒治療機制不同，故血清HBV RNA的臨床應用意義在這兩種治療方案中也存在差別。研究[18]指出，CHB患者在抗病毒治療過程中，IFN為基礎的治療比單用NAs治療更能降低HBV RNA載量，即使是HBeAg陽性患者在接受以IFN為基礎的抗病毒治療時，其HBV RNA載量的降低也高于NAs治療的患者。在IFN治療中，基線低水平的HBV RNA可預測HBeAg血清學轉換的發生，van B?mmel等[19]回顧性分析了接受PEG-IFNα-2a抗病毒治療的131例HBeAg陽性患者的血清標本，其中76例接受PEG-IFNα-2a單藥治療，55例接受PEG-IFNα-2a聯合拉米夫定治療，結果顯示，51%(39/76)的單藥治療患者及47%(26/55)的聯合治療患者發生了HBeAg血清學轉換，HBeAg血清學轉換患者基線血清HBV RNA水平顯著低于無應答者，在治療過程中和治療后隨訪的各個時間點，發生HBeAg血清學轉換的患者HBV RNA中位水平均較未發生轉換的患者低，治療12周和24周患者的HBV RNA水平顯示出良好的預測HBeAg血清學轉換率的能力。 張繼明教授團隊[20]的一項研究得出了相似的結論。因此在HBeAg陽性的CHB患者中，血清HBV RNA水平可作為一種預測HBeAg血清學轉換的新工具。

5 血清HBV RNA是CHB患者NAs停藥后復發的潛在預測因子

既往研究指出，以持續的HBV DNA未檢出(低于檢測下限)、ALT水平正常和HBeAg血清學轉換為前提停藥，仍存在很大的病毒學反彈和疾病復發風險。血清HBV RNA被認為是與cccDNA轉錄活性相關的臨床指標，血清HBV RNA的消失可能反映cccDNA的消失或轉錄沉默，并可能是抗病毒治療安全停藥的指標[8-9]。

Wang等[2]對33例接受標準NAs抗病毒治療且在治療結束時HBV DNA水平低于檢測下限的CHB患者進行隨訪，以治療結束后24周HBV DNA的重新出現作為研究終點，其中21例HBV RNA在治療結束時呈陽性的患者均出現了反彈，而12例HBV RNA水平低于檢測值下限的患者中僅有3例出現病毒反彈。該研究提示血清HBV RNA水平可能與停止NAs治療后HBV反彈的風險有關。另一項對36例CHB患者應用NAs治療的研究[21]發現，治療3個月時患者血清HBV DNA和HBV RNA水平與停藥24周后HBV DNA、ALT水平升高相關，監測此時間點的HBV DNA和HBV RNA水平可預測停止NAs治療后CHB患者的肝臟炎癥再活動。此結果在一項多中心前瞻性研究[22]中得到了驗證。該研究對130例HBeAg陽性接受替比夫定聯合或不聯合阿德福韋酯抗病毒治療的慢性HBV感染者進行了長期的隨訪。結果顯示，與HBV DNA或RNA陽性患者相比，治療結束時HBV DNA及RNA均陰性的患者臨床復發風險顯著降低(8.0% vs 31.4%)；多元回歸分析顯示，治療結束時HBV DNA和RNA水平是臨床復發(HBV DNA>2000 IU/ml且ALT>2倍正常值上限)(危險比=4.54)和病毒學復發(兩次檢測HBV DNA>2000 IU/ml)(危險比=11.10)的獨立預測因子，認為HBV總核酸水平(HBV DNA和HBV RNA)可以作為一個可靠的生物標志物來指導停藥。同時，有必要開發一種新的試劑盒，可以直接檢測HBV總核酸水平，以便更好、更簡單地監測治療反應和指導停藥。

血清HBsAg陰性有可能是由于S基因突變介導的HBsAg檢測能力差，而非真正的血清HBsAg清除[23]。經抗病毒治療后實現HBsAg消失的CHB患者仍會出現病毒反彈的風險[24]。有研究[25]指出血清HBV RNA可作為HBsAg逆轉的潛在預測因子。該研究對32例接受PEG-IFN單獨或聯合NAs治療后HBsAg和HBV DNA均達到血清學清除的CHB患者進行評估，治療結束時HBV RNA陽性的7例患者在停藥后均出現HBsAg和HBV DNA逆轉，而25例HBV RNA陰性患者中只有5例出現HBsAg逆轉和HBV DNA重現。治療結束時血清HBV RNA水平預測復合逆轉(包括HBsAg逆轉和HBV DNA重現)的陽性預測值為100%，陰性預測值為80%，表明在治療結束時血清HBV RNA陽性可以預測停藥后復合逆轉的風險。

6 小結

HBV RNA是一種新型HBV血清學標志物。近年來有關血清HBV RNA的研究越來越受到關注，雖然檢測方法各不相同，但已顯示出其初步的臨床意義。未來仍有許多問題有待探索。首先，血清HBV RNA的分子特征尚未明確，需要進一步的基礎研究確定血清HBV RNA的分子生物學特性，并評估其臨床潛力。其次，目前仍缺乏一種標準化的血清HBV RNA檢測方法，應制訂和研究一種標準化的，快速簡單、靈敏、穩定以及可重復的 HBV RNA檢測方法，用以滿足臨床HBV RNA快捷和可重復的檢測需求。最后，多項研究指出HBV RNA在抗病毒療效評價及預測停藥復發中的價值，通過HBV RNA檢測來預測和優選HBsAg清除優勢人群，可能有助于大幅度提高NAs經治CHB患者的臨床治愈率，但HBV RNA單獨或聯合其他指標預測治療終點仍需大樣本的前瞻性研究支持。