血清HBV RNA定量在指導(dǎo)慢性乙型肝炎抗病毒治療過程中的作用

卞丹丹， 鄭素軍

1 首都醫(yī)科大學(xué)電力教學(xué)醫(yī)院 感染性疾病科， 北京 100073； 2 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院 疑難肝病與人工肝中心， 北京 100069； 3 肝衰竭與人工肝治療研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100069

1 HBV RNA的形成

在HBV感染過程中，HBV病毒粒子通過與肝細(xì)胞受體牛磺膽酸鈉協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)多肽結(jié)合，將含有病毒松弛環(huán)狀DNA(rcDNA)的核衣殼釋放到肝細(xì)胞，HBV核心顆粒包含的rcDNA通過一系列機(jī)制被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞核，在細(xì)胞核中依賴HBV編碼的DNA聚合酶補(bǔ)齊兩條鏈上的缺口，最后形成HBV cccDNA[1]。cccDNA作為病毒轉(zhuǎn)錄的模板，可利用宿主細(xì)胞的RNA聚合酶進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生4種不同的RNA(3.5、2.4、2.1、0.7 kb)，其中3.5 kb的mRNA有兩種：前核心區(qū)RNA(PreC RNA)和前基因組RNA(pgRNA)，PreC RNA用于編碼HBeAg，pgRNA是新病毒逆轉(zhuǎn)錄及翻譯HBV聚合酶和核心蛋白的模板[2-3]。在衣殼內(nèi)，聚合酶通過反轉(zhuǎn)錄將pgRNA轉(zhuǎn)化為rcDNA，然后與病毒蛋白裝配成新的完整HBV釋放到細(xì)胞外，或再進(jìn)入細(xì)胞核補(bǔ)充cccDNA池[4]。有研究[2]證實(shí)，HBV感染者血清中的HBV RNA為pgRNA，其來源可能為核衣殼包裹的pgRNA在未啟動(dòng)逆轉(zhuǎn)錄的情況下，直接獲得包膜并從感染的肝細(xì)胞中釋放出來，被稱為“HBV RNA病毒樣顆粒”。

2 血清HBV RNA與肝臟組織內(nèi)cccDNA狀態(tài)的關(guān)系

由于肝組織內(nèi)HBV cccDNA的檢測(cè)需要做肝組織活檢，多數(shù)患者不愿意接受，在臨床應(yīng)用中存在較大的困難[5-7]。HBV pgRNA作為HBV cccDNA的直接轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，理論上HBV RNA水平能夠反映肝細(xì)胞內(nèi)cccDNA的水平及轉(zhuǎn)錄活性。

多項(xiàng)臨床及基礎(chǔ)研究顯示，外周血清中的HBV RNA水平與肝組織內(nèi)HBV cccDNA密切相關(guān)。Wang等[8]對(duì)62例HBeAg陽性和22例HBeAg陰性初治患者研究發(fā)現(xiàn)，HBeAg陽性患者的血清HBV RNA定量與肝內(nèi)cccDNA水平相關(guān)性良好，而HBeAg陰性患者的血清HBV RNA與肝內(nèi)cccDNA無相關(guān)性。該研究進(jìn)一步對(duì)41例經(jīng)核苷(酸)類似物(NAs)治療2年以上的慢性乙型肝炎(CHB)患者進(jìn)行了調(diào)查。其中，20例患者血清HBV RNA和肝內(nèi)cccDNA均陽性，9例血清HBV RNA和肝內(nèi)cccDNA均低于檢測(cè)下限，12例肝內(nèi)cccDNA陽性，但血清HBV RNA低于檢測(cè)下限。分析提示血清HBV RNA與肝內(nèi)cccDNA的存在與否及轉(zhuǎn)錄活性密切相關(guān)。另有一項(xiàng)針對(duì)47例使用恩替卡韋長期抗病毒治療且血清HBV RNA檢測(cè)不到患者的研究[9]也證實(shí)，血清HBV RNA水平與肝內(nèi)HBV RNA水平(r=0.725，P<0.001)及肝內(nèi)HBV RNA/cccDNA比值(r=0.584，P=0.001)密切相關(guān)，這些數(shù)據(jù)表明，血清HBV RNA水平反映了肝內(nèi)HBV RNA數(shù)量和cccDNA的HBV轉(zhuǎn)錄活性。Giersch等[10]對(duì)HBV感染小鼠模型血清pgRNA與肝內(nèi)pgRNA和cccDNA的研究發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)治療的HBV感染小鼠血清pgRNA水平與肝組織內(nèi)cccDNA水平顯著相關(guān)，而用PEG-IFNα治療后的小鼠血清pgRNA與cccDNA無相關(guān)性。有研究者[11]分析認(rèn)為可能是PEG-IFNα對(duì)cccDNA轉(zhuǎn)錄翻譯的表觀遺傳修飾降低了cccDNA的活性但不顯著影響cccDNA載量，并且PEG-IFNα可加速pgRNA降解或抑制其合成以降低HBV RNA水平，從而導(dǎo)致血清HBV RNA與cccDNA無相關(guān)性[12-13]。由上可知，不同HBeAg狀態(tài)、不同抗病毒藥物等因素均會(huì)影響循環(huán)HBV RNA的水平，因此，血清HBV RNA作為肝細(xì)胞內(nèi)cccDNA轉(zhuǎn)錄活性替代標(biāo)志物的臨床適用性尚待進(jìn)一步研究。

3 血清HBV RNA水平與肝組織學(xué)活性指標(biāo)的關(guān)系及預(yù)測(cè)價(jià)值

Wang等[9]研究指出HBV RNA的積累和低水平的病毒復(fù)制可能導(dǎo)致肝病進(jìn)展，該研究發(fā)現(xiàn)，血清HBV RNA水平與壞死性炎癥和纖維化組織病理學(xué)評(píng)分密切相關(guān)(Metavir炎癥分級(jí)：r=0.665，P<0.001；Metavir纖維化分期：r=0.722，P<0.001)。肝內(nèi)HBV RNA水平也觀察到類似結(jié)果。在NAs治療期間，血清HBV RNA水平在2.45 log10拷貝/ml時(shí)對(duì)區(qū)分輕度(Metavir評(píng)分<2分)和重度(Metavir評(píng)分≥2分)肝組織病理學(xué)的準(zhǔn)確性最高。這些數(shù)據(jù)表明，在接受長期NAs治療的患者中，HBV RNA水平與肝病進(jìn)展存在關(guān)聯(lián)。并且該研究通過原位雜交的方法觀察到HBV RNA嚴(yán)格分布在肝細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，HBV RNA陽性的肝細(xì)胞呈灶狀聚集，零星分布于肝小葉，與HBsAg共定位。提示即使在長期恩替卡韋治療后，病毒轉(zhuǎn)錄活性在肝臟的某些解剖部位仍持續(xù)存在。

4 CHB患者抗病毒治療過程中血清HBV RNA水平在病毒學(xué)應(yīng)答中的預(yù)測(cè)作用

多數(shù)研究表明，血清HBV RNA可作為監(jiān)測(cè)抗病毒治療效果的有用指標(biāo)。Huang等[14]一項(xiàng)針對(duì)52例CHB患者接受NAs(拉米夫定26例，恩替卡韋26例)抗病毒治療的研究發(fā)現(xiàn)，與血清HBV DNA水平從可檢測(cè)到不可檢測(cè)時(shí)間間隔≥16周的CHB患者相比，間隔<16周的患者在治療第12周時(shí)血清HBV RNA水平顯著降低。血清HBV RNA是此類患者最初病毒學(xué)反應(yīng)(HBV DNA首次小于檢測(cè)值下限)的唯一獨(dú)立治療預(yù)測(cè)因子。印度的一項(xiàng)研究[15]對(duì)91例HBeAg陰性CHB患者的血清樣本進(jìn)行了回顧性分析，這些患者曾單獨(dú)應(yīng)用PEG-IFN或聯(lián)合恩替卡韋抗病毒治療48周，在治療后3年的隨訪中，維持病毒學(xué)應(yīng)答率(定義為持續(xù)HBV DNA<2000 IU/ml)和HBsAg清除率分別為37.4%(34/91)和7.7%(7/91)。治療前血清低水平的HBV RNA和HBsAg與維持病毒學(xué)應(yīng)答獨(dú)立相關(guān)。由此提出在PEG-IFN治療前HBV RNA水平可以預(yù)測(cè)獲得維持病毒學(xué)應(yīng)答的高概率患者，有助于個(gè)體化決策。

對(duì)于HBeAg陽性患者，無論是自發(fā)還是治療誘導(dǎo)的血清學(xué)轉(zhuǎn)換，都被認(rèn)為是HBsAg丟失或血清轉(zhuǎn)換的先決條件。血清HBV RNA水平可作為NAs治療過程中HBeAg血清轉(zhuǎn)換的早期預(yù)測(cè)指標(biāo)。van B?mmel等[16]在對(duì)50例接受富馬酸替諾福韋酯或拉米夫定治療的HBeAg陽性患者的研究中指出，治療過程中患者血清HBV RNA水平的變化與有無發(fā)生HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換密切相關(guān)。與未發(fā)生HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的患者相比，發(fā)生血清學(xué)轉(zhuǎn)換患者治療過程中HBV RNA水平下降更快。多因素分析顯示，與HBV RNA、HBsAg、ALT、HBV基因型、年齡和性別相比，治療第3個(gè)月和第6個(gè)月HBV RNA水平下降是HBeAg血清轉(zhuǎn)換的最強(qiáng)預(yù)測(cè)因子。Luo等[17]對(duì)98例應(yīng)用NAs抗病毒治療長達(dá)7年的CHB患者進(jìn)行研究，logistic回歸模型顯示治療48周后HBV RNA陽性是HBeAg未清除的危險(xiǎn)因素(風(fēng)險(xiǎn)比=6.69)，并且在NAs長期抗病毒治療過程中，血清HBV RNA陽性患者也需要更多的時(shí)間來達(dá)到HBeAg清除。因此，治療48周后HBV RNA陽性患者更難達(dá)到治療終點(diǎn)，這些患者在治療過程中亦會(huì)產(chǎn)生更大的經(jīng)濟(jì)壓力。

由于NAs與IFN抗病毒治療機(jī)制不同，故血清HBV RNA的臨床應(yīng)用意義在這兩種治療方案中也存在差別。研究[18]指出，CHB患者在抗病毒治療過程中，IFN為基礎(chǔ)的治療比單用NAs治療更能降低HBV RNA載量，即使是HBeAg陽性患者在接受以IFN為基礎(chǔ)的抗病毒治療時(shí)，其HBV RNA載量的降低也高于NAs治療的患者。在IFN治療中，基線低水平的HBV RNA可預(yù)測(cè)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的發(fā)生，van B?mmel等[19]回顧性分析了接受PEG-IFNα-2a抗病毒治療的131例HBeAg陽性患者的血清標(biāo)本，其中76例接受PEG-IFNα-2a單藥治療，55例接受PEG-IFNα-2a聯(lián)合拉米夫定治療，結(jié)果顯示，51%(39/76)的單藥治療患者及47%(26/55)的聯(lián)合治療患者發(fā)生了HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換，HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換患者基線血清HBV RNA水平顯著低于無應(yīng)答者，在治療過程中和治療后隨訪的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，發(fā)生HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的患者HBV RNA中位水平均較未發(fā)生轉(zhuǎn)換的患者低，治療12周和24周患者的HBV RNA水平顯示出良好的預(yù)測(cè)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率的能力。 張繼明教授團(tuán)隊(duì)[20]的一項(xiàng)研究得出了相似的結(jié)論。因此在HBeAg陽性的CHB患者中，血清HBV RNA水平可作為一種預(yù)測(cè)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的新工具。

5 血清HBV RNA是CHB患者NAs停藥后復(fù)發(fā)的潛在預(yù)測(cè)因子

既往研究指出，以持續(xù)的HBV DNA未檢出(低于檢測(cè)下限)、ALT水平正常和HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換為前提停藥，仍存在很大的病毒學(xué)反彈和疾病復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。血清HBV RNA被認(rèn)為是與cccDNA轉(zhuǎn)錄活性相關(guān)的臨床指標(biāo)，血清HBV RNA的消失可能反映cccDNA的消失或轉(zhuǎn)錄沉默，并可能是抗病毒治療安全停藥的指標(biāo)[8-9]。

Wang等[2]對(duì)33例接受標(biāo)準(zhǔn)NAs抗病毒治療且在治療結(jié)束時(shí)HBV DNA水平低于檢測(cè)下限的CHB患者進(jìn)行隨訪，以治療結(jié)束后24周HBV DNA的重新出現(xiàn)作為研究終點(diǎn)，其中21例HBV RNA在治療結(jié)束時(shí)呈陽性的患者均出現(xiàn)了反彈，而12例HBV RNA水平低于檢測(cè)值下限的患者中僅有3例出現(xiàn)病毒反彈。該研究提示血清HBV RNA水平可能與停止NAs治療后HBV反彈的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。另一項(xiàng)對(duì)36例CHB患者應(yīng)用NAs治療的研究[21]發(fā)現(xiàn)，治療3個(gè)月時(shí)患者血清HBV DNA和HBV RNA水平與停藥24周后HBV DNA、ALT水平升高相關(guān)，監(jiān)測(cè)此時(shí)間點(diǎn)的HBV DNA和HBV RNA水平可預(yù)測(cè)停止NAs治療后CHB患者的肝臟炎癥再活動(dòng)。此結(jié)果在一項(xiàng)多中心前瞻性研究[22]中得到了驗(yàn)證。該研究對(duì)130例HBeAg陽性接受替比夫定聯(lián)合或不聯(lián)合阿德福韋酯抗病毒治療的慢性HBV感染者進(jìn)行了長期的隨訪。結(jié)果顯示，與HBV DNA或RNA陽性患者相比，治療結(jié)束時(shí)HBV DNA及RNA均陰性的患者臨床復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)顯著降低(8.0% vs 31.4%)；多元回歸分析顯示，治療結(jié)束時(shí)HBV DNA和RNA水平是臨床復(fù)發(fā)(HBV DNA>2000 IU/ml且ALT>2倍正常值上限)(危險(xiǎn)比=4.54)和病毒學(xué)復(fù)發(fā)(兩次檢測(cè)HBV DNA>2000 IU/ml)(危險(xiǎn)比=11.10)的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，認(rèn)為HBV總核酸水平(HBV DNA和HBV RNA)可以作為一個(gè)可靠的生物標(biāo)志物來指導(dǎo)停藥。同時(shí)，有必要開發(fā)一種新的試劑盒，可以直接檢測(cè)HBV總核酸水平，以便更好、更簡單地監(jiān)測(cè)治療反應(yīng)和指導(dǎo)停藥。

血清HBsAg陰性有可能是由于S基因突變介導(dǎo)的HBsAg檢測(cè)能力差，而非真正的血清HBsAg清除[23]。經(jīng)抗病毒治療后實(shí)現(xiàn)HBsAg消失的CHB患者仍會(huì)出現(xiàn)病毒反彈的風(fēng)險(xiǎn)[24]。有研究[25]指出血清HBV RNA可作為HBsAg逆轉(zhuǎn)的潛在預(yù)測(cè)因子。該研究對(duì)32例接受PEG-IFN單獨(dú)或聯(lián)合NAs治療后HBsAg和HBV DNA均達(dá)到血清學(xué)清除的CHB患者進(jìn)行評(píng)估，治療結(jié)束時(shí)HBV RNA陽性的7例患者在停藥后均出現(xiàn)HBsAg和HBV DNA逆轉(zhuǎn)，而25例HBV RNA陰性患者中只有5例出現(xiàn)HBsAg逆轉(zhuǎn)和HBV DNA重現(xiàn)。治療結(jié)束時(shí)血清HBV RNA水平預(yù)測(cè)復(fù)合逆轉(zhuǎn)(包括HBsAg逆轉(zhuǎn)和HBV DNA重現(xiàn))的陽性預(yù)測(cè)值為100%，陰性預(yù)測(cè)值為80%，表明在治療結(jié)束時(shí)血清HBV RNA陽性可以預(yù)測(cè)停藥后復(fù)合逆轉(zhuǎn)的風(fēng)險(xiǎn)。

6 小結(jié)

HBV RNA是一種新型HBV血清學(xué)標(biāo)志物。近年來有關(guān)血清HBV RNA的研究越來越受到關(guān)注，雖然檢測(cè)方法各不相同，但已顯示出其初步的臨床意義。未來仍有許多問題有待探索。首先，血清HBV RNA的分子特征尚未明確，需要進(jìn)一步的基礎(chǔ)研究確定血清HBV RNA的分子生物學(xué)特性，并評(píng)估其臨床潛力。其次，目前仍缺乏一種標(biāo)準(zhǔn)化的血清HBV RNA檢測(cè)方法，應(yīng)制訂和研究一種標(biāo)準(zhǔn)化的，快速簡單、靈敏、穩(wěn)定以及可重復(fù)的 HBV RNA檢測(cè)方法，用以滿足臨床HBV RNA快捷和可重復(fù)的檢測(cè)需求。最后，多項(xiàng)研究指出HBV RNA在抗病毒療效評(píng)價(jià)及預(yù)測(cè)停藥復(fù)發(fā)中的價(jià)值，通過HBV RNA檢測(cè)來預(yù)測(cè)和優(yōu)選HBsAg清除優(yōu)勢(shì)人群，可能有助于大幅度提高NAs經(jīng)治CHB患者的臨床治愈率，但HBV RNA單獨(dú)或聯(lián)合其他指標(biāo)預(yù)測(cè)治療終點(diǎn)仍需大樣本的前瞻性研究支持。