野生黑茶抗氧化活性研究

何英姿 王曉 梁傳順 李穩(wěn) 潘慶松 覃繼忠

摘 要：本文分別用三種不同極性的溶劑（石油醚、乙酸乙酯和正丁醇）提取野生黑茶中抗氧化活性物質(zhì)，并測(cè)定了三種自由基的清除率，與合成抗氧化劑Vc和蘆丁進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果表明：隨著野生黑茶提取物濃度的增加，其對(duì)DPPH自由基、·OH自由基和超氧陰離子的清除能力逐漸增強(qiáng)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)野生黑茶對(duì)DPPH自由基和·OH自由基清除能力都是乙酸乙酯提取物的自由基清除活性較強(qiáng)。黑茶提取物對(duì)DPPH自由基·OH自由基的清除率分別到達(dá)93.63%和77.85%。而對(duì)超氧陰離子自由基則是正丁醇相提取物的自由基清除活力較強(qiáng)，清除率達(dá)到42.25%。結(jié)論：野生黑茶不同溶劑提取物對(duì)三種自由基的清除效果良好，說(shuō)明其中富含抗氧化活性物質(zhì)，這為野生黑茶的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：野生黑茶;極性溶劑;提取物;自由基清除率;抗氧化

Abstract：In this paper，the antioxidant active substances were extracted from Wild Dark Tea respectively with three different polar solvent（petroleum ether，ethyl acetate and n-butanol）.The scavenging activity was determined on both DPPH，hydroxyl radicals（·OH）and superoxide anion，and was compared with synthetic antioxidant vitamin C and rutin.The results showed that：in the experimental concentration range，with the increase of the extract concentration，the scavenging capacity on DPPH radical，hydroxyl radical and superoxide anion radical gradually increased，and also found that the ethyl acetate extraction of Wild Dark Tea had stronger scavenging capacity on DPPH radical and hydroxyl radicals.The scavenging capacity radical can reach 93.63% and 77.85% respectively.While the scavenging activity on superoxide anion radical was stronger in chloroform extraction，and the radical scavenging rate was 42.25%.In conclusion，the extractions of Wild Dark Tea in different polar solvent had effectively scavenging activity on DPPH radical，hydroxyl radicals and superoxide anion radical.So Wild Dark Tea is rich in antioxidant active substances.These can provide the reference basis for the further development and utilization of Wild Dark Tea.

Key words：Wild Dark Tea; polar solvent; extract; radical scavenging; antioxidant

廣西柳州市融水縣原始森林里的原生品種茶樹，優(yōu)良的品質(zhì)和特有的風(fēng)味受到了很多專家和學(xué)者的青睞和高度重視，國(guó)家農(nóng)業(yè)部、科技部相繼在融水建設(shè)“廣西元寶山野生茶種質(zhì)資源原生境保護(hù)區(qū)”和全國(guó)唯一一個(gè)“國(guó)家茶產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)研發(fā)中心，使得本地黑茶產(chǎn)品特色與品質(zhì)、原始稀缺性、安全性等各方面均表現(xiàn)出得天獨(dú)厚的自然優(yōu)勢(shì)。黑茶的抗氧化活性一直以來(lái)備受矚目。普洱茶作為黑茶的代表被廣泛研究。金裕范等[1]對(duì)普洱茶清除DPPH自由基的效率進(jìn)行了測(cè)試，發(fā)現(xiàn)5個(gè)產(chǎn)地的普洱茶均具有能不同程度地清除DPPH自由基，并隨產(chǎn)地不同而有差別。有學(xué)者[2]研究發(fā)現(xiàn)普洱茶對(duì)羥基自由基有很好的清除能力。還有學(xué)者[3]采用不同的有機(jī)溶劑萃取普洱茶提取物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)普洱茶乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物對(duì)羥基自由基和DPPH均有較好的清除效果。對(duì)于廣西柳州市融水縣的野生黑茶，未見研究報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇提取野生黑茶的抗氧化活性物質(zhì)，通過(guò)測(cè)定其自由基清除能力，研究野生黑茶的抗氧化性能，旨在為進(jìn)一步開發(fā)和利用野生黑茶提供參考。

1 試驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

（1）實(shí)驗(yàn)藥品試劑。野生黑茶由廣西柳州市融水縣水融香茶業(yè)有限公司提供。DPPH·自由基（二苯代苦味肼基自由基）購(gòu)于上?？笊锛夹g(shù)有限公司，蘆丁購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、PBS緩沖液、鄰二氮菲（菲啰啉）、FeSO4·7H2O、去離子水、H2O2，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

（2）儀器與設(shè)備。手提式高速中藥粉碎機(jī)、標(biāo)準(zhǔn)篩、分析天平、真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、抽濾裝置、紫外可見分光光度計(jì)、電熱恒溫水浴鍋、冷凍干燥器、超聲波清洗機(jī)、調(diào)溫電熱套。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

（1）樣品制備。先將野生黑茶粉碎，用標(biāo)準(zhǔn)篩進(jìn)行篩選備用[4]。稱取野生黑茶粉末兩千克，放在95%的乙醇中浸泡幾天。過(guò)濾浸提液，再用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓懸蒸，得總浸膏55.2g。取蒸餾水溶解浸膏，超聲溶解后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，萃取所得提取液減壓濃縮至浸膏，分別得到石油醚相92545g，乙酸乙酯相17.7129g，正丁醇相221440g，水相44968g。將各樣品冷凍干燥后，置于冰箱中保存?zhèn)溆肹5]。

（2）DPPH自由基的清除能力測(cè)定。分別將野生黑茶提取液經(jīng)萃取后的各極性部分浸膏、蘆丁和Vc，用無(wú)水乙醇配制成濃度為1mg/mL的溶液，做DPPH自由基的清除能力測(cè)定時(shí)再分別稀釋至0.05、0.10、0.15、020、0.25mg/mL。用分析天平準(zhǔn)確稱量DPPH0.0597g，然后用無(wú)水乙醇溶解定容至250ml容量瓶中，即可得到濃度為6×10-4mol/L的DPPH溶液，備用，避光冷藏。

按表1中加入溶液后充分搖勻，靜置在黑暗處30min，用無(wú)水乙醇為空白，在波長(zhǎng)517nm下測(cè)定溶液A0、Ai、Aj相對(duì)應(yīng)的吸光度值，記錄數(shù)據(jù)，根據(jù)清除率公式計(jì)算其清除率值[6]。

（3）測(cè)定羥基自由基的清除能力。①最大吸收波長(zhǎng)的確定：取10mL具塞比色管，逐一加入0.8mmol/L鄰二氮菲溶液3mL，PBS緩沖溶液4mL，去離子水1mL，混合均勻，再滴加08mmol/L的硫酸亞鐵溶液1mL，接著滴加95%的乙醇1mL，搖勻后放在37℃的水浴中溫浴1h，空白對(duì)照為去離子水，在紫外-可見分光光度計(jì)上190nm～800nm進(jìn)行波譜掃描，確定最大吸收波長(zhǎng)為510nm[7]。②樣品測(cè)定：取10mL具塞比色管，逐一加入0.8mmol/L鄰二氮菲溶液3mL，PBS緩沖溶液4mL，去離子水1mL，混合均勻，再滴加0.8mmol/L的硫酸亞鐵溶液1mL，即獲得反應(yīng)液;然后按表2加入不同溶液進(jìn)行測(cè)定。

分別取1mg/mL的樣品（對(duì)照為Vc）溶液0.2、0.4、0.6、08、1.0mL放入帶塞子的比色管中，然后對(duì)應(yīng)加入0.8、0.6、04、0.2、0mL的去離子水，搖勻，逐一加入鄰二氮菲溶液3mL，PBS緩沖溶液4mL，搖勻后加入硫酸亞鐵溶液和H2O2溶液各1mL，于37℃的水浴鍋中溫?zé)嵋恍r(shí)，在波長(zhǎng)為510nm處測(cè)定吸光度值，記為Aj。溶液羥基自由基清除率公式：

（4）測(cè)定超氧陰離子自由基的清除作用。①最大吸收波長(zhǎng)的確定：將3mL Tris-HCI緩沖溶液、4mL鄰苯三酚溶液逐一加入10mL的比色管中，震蕩搖勻，用蒸餾水定容至刻度。將蒸餾水作為空白對(duì)照，在紫外-可見分光光度計(jì)190nm～800nm范圍內(nèi)掃描，從而確定出最大吸收波長(zhǎng)為320nm。②樣品測(cè)定：分別取1mg/mL的樣品溶液（對(duì)照為蘆?。?、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于10mL的比色管中，逐一加入Tris-HCl緩沖溶液3mL、鄰苯三酚溶液4mL，讓其充分反應(yīng)5min后，用0.1mol/L的鹽酸溶液終止反應(yīng)，滴入蒸餾水補(bǔ)充至刻度，在320nm處測(cè)得吸光度值A(chǔ)0、Ai。另外取1mg/mL的樣品溶液0.2、0.4、06、0.8、1.0mL，分別加入3mLTris-HCl緩沖溶液、0.1mL鹽酸溶液于10mL比色管中，用蒸餾水定容至刻度，在波長(zhǎng)320nm處測(cè)其吸光度值A(chǔ)j。

其中，A0為鄰苯三酚自氧化的空白吸光度值;Ai為加入樣品后鄰苯三酚自氧化的吸光度值;Aj為樣品和緩沖溶液的吸光度值，即樣品樣色對(duì)自氧化的干擾值[9]，作圖分析清除率作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生黑茶中各極性萃取物對(duì)DPPH的自由基的清除

根據(jù)所得數(shù)據(jù)作圖，如圖1所示，各極性萃取物對(duì)DPPH的自由基清除率均隨著樣品濃度值增加而增大，對(duì)照品Vc的活性最高，石油醚相最低，當(dāng)樣品濃度增加到015—025mg/mL時(shí)，表現(xiàn)比較好的是乙酸乙酯相和正丁醇相，兩者的清除率均高于對(duì)照品蘆丁的清除率，并非常接近對(duì)照品Vc的清除率值，達(dá)到了93.63%。通過(guò)數(shù)據(jù)分析可知野生黑茶有較好的清除DPPH自由基的活性。

2.2 野生黑茶中各極性萃取物對(duì)羥基自由基的清除

通過(guò)作圖分析可知（如圖2），各極性部分的清除率基本隨濃度的增加而遞增，其中乙酸乙酯相遞增最快，在0.4mg/mL時(shí)高于其他各相，隨著濃度持續(xù)增加，各極性萃取物對(duì)羥自由基的清除能力繼續(xù)增大，并逐漸趨于穩(wěn)定，各相中以乙酸乙酯相的清除率為最好，和Vc的清除率值比較接近，達(dá)到77.85%。因此，野生黑茶對(duì)羥自由基有較好的清除活性。

2.3 野生黑茶中各極性萃取物對(duì)超氧陰離子自由基的清除

通過(guò)作圖分析可知（如圖3），樣品對(duì)超氧陰離子自由基的清除率基本是隨著各自濃度的增加而呈上升趨勢(shì)。在0.4～0.8mg/mL時(shí)，正丁醇相顯示出較好的抗氧化活性，其清除率高于對(duì)照品蘆丁。在濃度為1mg/mL時(shí)，正丁醇相的清除效率最好，達(dá)到42.25%，但比對(duì)照品蘆丁低，其次是乙酸乙酯相和石油醚相?？芍吧诓鑼?duì)超氧陰離子自由基有較好的清除活性。

3 結(jié)論

本文主要對(duì)野生黑茶不同極性溶劑提取物的抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定，選取了DPPH自由、羥基自由基和超氧陰離子自由基進(jìn)行清除率實(shí)驗(yàn)，用Vc和蘆丁作為對(duì)照品。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，野生黑茶各極性部分均有較好的抗氧化活性，其中對(duì)DPPH自由基的清除效果最好，乙酸乙酯相和正丁醇相的清除率接近于對(duì)照品Vc的清除率;對(duì)羥基自由基的清除則是乙酸乙酯相的效果最好，明顯高于其他三相的清除率;而正丁醇相對(duì)超氧陰離子自由基的清除最好，與對(duì)照品蘆丁比較接近。因此，通過(guò)對(duì)比數(shù)據(jù)可知，野生黑茶提取物的乙酸乙酯相、正丁醇相活性較好，這為野生黑茶的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了參考依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]金裕范，高雪巖，王文全，等.云南普洱茶抗氧化活性的比較研究[J].中國(guó)現(xiàn)代中藥，2011，13（8）：17-19.

[2]Lin Y S，Tsai Y J，Tsay J S，et al.Factors affecting the levels of tea polyphenols and caffeine in tea leaves[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2003，51（7）：1864-1873.

[3]揭國(guó)良，何普明，丁仁鳳.普洱茶抗氧化特性的初步研究[J].茶葉，2005，31（3）：162-165.

[4]何英姿，逯釗琦，陳艷芳，等.六堡茶茶褐素的提取工藝及其抗氧化活性研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，40（35）：17301-17303.

[5]張文博.植物樣品成分的體外抗氧化活性方法研究進(jìn)展[J].廣州化工，2011，39（24）：14-16.

[6]聶少平，謝明勇，羅珍.用清除有機(jī)自由基DPPH法評(píng)價(jià)茶葉多糖的抗氧化活性[J].食品科學(xué)，2006，27（3）：34-36.

[7]李慎新，曹新志.幾種茶葉中抗氧化性物質(zhì)的比較研究[J].四川理工學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2009，22（4）：82-84.

[8]楊少輝，宋英今，王潔華.雪蓮果體外抗氧化和自由基清除能力[J].食品科學(xué)，2010，31（17）：166-169.

[9]林祥潮，黃曉東.中藥對(duì)超氧陰離子自由基清除率的測(cè)定[J].廣州化學(xué)，2012，37（1）：32-36.