重組人2型松弛素對(duì)人支氣管上皮Bease-2B細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的抑制作用的時(shí)間相關(guān)性研究

劉國(guó)清 馬繼龍 謝立波

摘 要：目的：通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探索重組人2型松弛素（RLN2）參與抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞Bease-2B細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程。方法：本研究選取Bease-2B細(xì)胞株作為模式細(xì)胞，體外培養(yǎng)。1）通過觀察細(xì)胞形態(tài)變化初步確定TGF-β1誘導(dǎo)濃度以及RLN2對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的Bease-2B細(xì)胞EMT的有效干預(yù)濃度;2）RLN2抑制TGF-β1誘導(dǎo)Bease-2B細(xì)胞EMT的時(shí)間：將細(xì)胞分別于TGF-β1誘導(dǎo)的同時(shí)和誘導(dǎo)24小時(shí)后加入RLN2培養(yǎng)24小時(shí)，及在TGF-β1誘導(dǎo)24小時(shí)后加入RLN2組分別作用24小時(shí)和48小時(shí)后：①通過觀察細(xì)胞遷移能力推測(cè)RLN2不同作用時(shí)間對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞EMT抑制效果;②通過Western bloting法檢測(cè)各組間質(zhì)標(biāo)志ACTA2，上皮標(biāo)志E-Cadhrin表達(dá)情況分析抑制效果與作用時(shí)間的關(guān)系。結(jié)果：1）觀察細(xì)胞形態(tài)變化：與正常組比，10ng/mL TGF-β1誘導(dǎo)組Bease-2b細(xì)胞由鋪路石狀上皮形態(tài)逐漸變成梭形、針葉型，且細(xì)胞之間的間隙變大，胞間的連接變得松散;加不同濃度的RLN2抑制細(xì)胞48小時(shí)后，與單純TGF-β1組相比，梭形形態(tài)的細(xì)胞減少，部分恢復(fù)鋪路石狀上皮形態(tài)，但細(xì)胞間連接仍然松散，其中TGF-β1同時(shí)加RLN2 80ng/mL組表現(xiàn)明顯。2）遷移能力，各組與單純TGF-β1誘導(dǎo)組比較平均遷移距離均減小，誘導(dǎo)24小時(shí)后加RLN2抑制組比誘導(dǎo)抑制同時(shí)進(jìn)行的組的遷移距離大，誘導(dǎo)24小時(shí)后加RLN2培養(yǎng)48小時(shí)組比抑制24小時(shí)組遷移距離小。3）Western bloting檢測(cè)分析抑制效果與時(shí)間的關(guān)系：?jiǎn)渭僐LN2組和正常組比較E-Cadhrin和ACTA2蛋白的表達(dá)均無顯著性差異;各組與單純TGF-β1組比較E-Cadhrin表達(dá)量均增加，ACTA2蛋白的表達(dá)減少;誘導(dǎo)抑制同時(shí)進(jìn)行的組與誘導(dǎo)24小時(shí)后加RLN2抑制組比較E-Cadhrin表達(dá)量增加，ACTA2蛋白的表達(dá)減少;誘導(dǎo)24小時(shí)后加RLN2培養(yǎng)48小時(shí)抑制組比抑制4小時(shí)組ACTA2蛋白的表達(dá)少，E-Cadhrin表達(dá)量無差別。結(jié)論：①TGF-β1可誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為間質(zhì)細(xì)胞。②松弛素可在一定程度上抑制TGF-β1誘導(dǎo)的EMT過程且與作用時(shí)間相關(guān)。③松弛素可能通過抑制TGF-β1誘導(dǎo)的EMT過程發(fā)揮抗纖維化作用。

關(guān)鍵詞：2型松弛素;上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化;轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1;Bease-2B細(xì)胞

兒童支氣管哮喘、閉塞性細(xì)支管炎、反復(fù)呼吸道感染等疾病常導(dǎo)致氣管、支氣管及其周圍的慢性炎癥，長(zhǎng)期反復(fù)的炎癥刺激和上皮損傷最終會(huì)導(dǎo)致細(xì)支氣管黏膜、黏膜下和管壁外周的纖維化和小氣道的重塑[1]，嚴(yán)重的氣道重塑可致氣道狹窄甚至阻塞，引起肺功能不全。覆蓋于氣道表層的上皮，在反復(fù)的損傷和不良刺激下會(huì)導(dǎo)致上皮細(xì)胞的完整性和固有特性被打亂和重排，發(fā)生形態(tài)和功能的改變，上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）就是其中之一，近年國(guó)內(nèi)外研究表明肺泡上皮細(xì)胞-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化是氣道纖維化的重要機(jī)制之一[2]。松弛素（RLN）是一類功能廣泛的細(xì)胞因子，越來越多的證據(jù)表明RLN具有抗纖維化作用[3]，其作用可能主要是通過抑制TGF-β1的活性，從而抑制成纖維細(xì)胞的增殖、分化，和抑制膠原的合成、分泌和沉積達(dá)到的。本研究通過TGF-β1誘導(dǎo)的支氣管上皮細(xì)胞的體外上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)探討重組人2型松弛素對(duì)支氣管上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化抑制作用的時(shí)間相關(guān)性。

1 材料

Bease-2B細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞典藏庫(kù)，重組人2型松弛素美國(guó)Peprotech公司生產(chǎn)，重組人TGF-β1上海近岸蛋白科技公司生產(chǎn)，E-cadherin抗體、α-SMA抗體Proteintech公司生產(chǎn)，DMI3000B熒光倒置顯微鏡購(gòu)自德國(guó)徠卡儀器公司。

2 方法

2.1 Bease-2B細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)前處理

采用含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)基，37℃恒溫、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)條件。常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞和傳代。選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，在傳代過程中逐漸降低培養(yǎng)液的胎牛血清含量，選擇適應(yīng)4%FBS的培養(yǎng)基的細(xì)胞接種于六孔板常規(guī)培養(yǎng)，至細(xì)胞融合度達(dá)到70%左右時(shí)，換為含1%FBS的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)12h，然后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 Bease-2B細(xì)胞的向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化

通過文獻(xiàn)得知，5ng/mL、10ng/mL的TGF-β1可以在體外誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞[4，5];經(jīng)過實(shí)驗(yàn)觀察得出10ng/mL的TGF-β1培養(yǎng)48h及以上，可誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞（Bease-2B）明顯轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞表型，即細(xì)胞從鵝卵石樣逐步轉(zhuǎn)變成梭形或長(zhǎng)條形，轉(zhuǎn)化成功率高。

2.3 顯微鏡觀察不同濃度RLN2對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響

經(jīng)過查文獻(xiàn)得知，以往松弛素在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中的濃度是10ng/mL、100ng/mL[6，7]，本研究通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，初步確定80ng/mL的RLN2對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化的抑制明顯，且對(duì)細(xì)胞存活干擾較小。

2.4 RLN2作用時(shí)間對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)細(xì)胞遷移能力的影響

穩(wěn)定傳代饑餓處理好的細(xì)胞分六組并編號(hào)k、t、t+48r、t+24r、r、t+r，k組換為1%FBSRPMI1640培養(yǎng)基，t、t+48r、t+24r組換為含10ng/mL TGF-β1的1%FBS培養(yǎng)液，t+r組為含80ng/mL RLN2及10ng/mL TGF-β1的FBS培養(yǎng)液，r組只含80ng/mL RLN2的FBS培養(yǎng)液，連續(xù)培養(yǎng)24h后，用無菌200μL移液器槍頭在細(xì)胞層垂直六孔板做3條平行劃痕，t+24r、t+48r組改為含80ng/mL RLN2及10ng/mL TGF-β1的1%FBS培養(yǎng)液，其他組所換培養(yǎng)液不變，t+24r組繼續(xù)培養(yǎng)24h，t+48r組培養(yǎng)48h，置于倒置顯微鏡下觀察并照相記錄，并用記號(hào)筆圈標(biāo)顯微鏡在六孔板蓋上的光斑，作為后續(xù)觀察記錄點(diǎn)，以后每隔8h觀察記錄一次，結(jié)果如圖1A所示。利用ImageJ2軟件，測(cè)量劃痕倆側(cè)細(xì)胞間距，對(duì)24h后細(xì)胞遷移的距離進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.5 Western blotting法檢測(cè)Bease-2B細(xì)胞在經(jīng)過TGF-β1和RLN2處理不同時(shí)間后E-Cad、ACTA2蛋白的表達(dá)情況

穩(wěn)定傳代饑餓處理好的細(xì)胞分六組并編號(hào)k、t、t+24r、t+48r、r、t+r，k組換為1%FBSRPMI1640培養(yǎng)基，t、t+24r、t+48r組換含10ng/mL TGF-β1的1%FBS培養(yǎng)液，t+r組換含80ng/mL的RLN2及10ng/mL的TGF-β1的1%FBS培養(yǎng)液，r組換含80ng/mL的RLN2的1%FBS培養(yǎng)液，連續(xù)培養(yǎng)24h后，t+24r、t+48r組改為含80ng/mL RLN2及10ng/mL TGF-β1的FBS培養(yǎng)液，其他組所換培養(yǎng)液不變，t+24r組持續(xù)培養(yǎng)24h，t+48r組繼續(xù)培養(yǎng)48h。最后提蛋白進(jìn)行Western blotting檢測(cè)，結(jié)果見圖2A，用ImageJ圖像分析軟件測(cè)條帶的灰度后，分別用E-Cadhrin蛋白和ACTA2蛋白的灰度條帶參數(shù)值除以β-actin蛋白條帶的灰度參數(shù)值得出相對(duì)蛋白含量，結(jié)果見圖2B。

圖2 Western blotting法檢測(cè)Bease-2B細(xì)胞在經(jīng)過TGF-β1和RLN2處理不同時(shí)間后E-Cad、ACTA2蛋白的表達(dá)情況

注：1空白對(duì)照組，2 TGF-β1組，3. 先TGF-β1后加RLN2培養(yǎng)48h組，4 先TGF-β1后加RLN2培養(yǎng)24h組，5. RLN2對(duì)照組，6.TGF-β1與RLN2 同時(shí)加入培養(yǎng)48h組，*P<0.05

3 結(jié)果

3.1 RLN2作用時(shí)間對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)細(xì)胞遷移能力的影響

各組的平均遷移距離分別為：0.20±0.70μm、21.74±115μm、13.17±1.10μm、17.53±1.00μm、0.52±0.91μm、291±1.01μm，單純松弛素r組和空白組兩者對(duì)照無顯著性差異（P>0.05），各組跟單純TGF-β1誘導(dǎo)的t組比較平均遷移距離均減小（P<0.05），誘導(dǎo)24小時(shí)后加RLN2抑制的t+48r組與誘導(dǎo)和抑制同時(shí)進(jìn)行的t+r組比較遷移距離增加（P<0.05），誘導(dǎo)24小時(shí)后加RLN2培養(yǎng)48小時(shí)抑制的t+48r組與培養(yǎng)24小時(shí)抑制的t+24r組比較遷移距離減少（P<0.05），見圖1B。另外在長(zhǎng)時(shí)間的饑餓培養(yǎng)過程中由于細(xì)胞的死亡空白組的劃痕間距有所增寬，而在相同培養(yǎng)時(shí)間里單純應(yīng)用RLN2的組細(xì)胞死亡數(shù)量較少，此現(xiàn)象可能是因?yàn)镽LN2提高了細(xì)胞在饑餓培養(yǎng)中的耐受力。

3.2 Western blotting法檢測(cè)Bease-2B細(xì)胞在經(jīng)過TGF-β1和RLN2處理不同時(shí)間后E-Cad、ACTA2蛋白的表達(dá)情況

單純RLN2組和空白對(duì)照組兩者比較E-Cadhrin蛋白和ACTA2蛋白的表達(dá)無顯著性差異（P>0.05）;各組與單純TGF-β1組比較E-Cadhrin蛋白表達(dá)量均增加（P<0.05），ACTA2蛋白的表達(dá)減少（P<0.05）;誘導(dǎo)和抑制同時(shí)進(jìn)行的t+r組與誘導(dǎo)48小時(shí)后加RLN2抑制的t+48r組比較E-Cadhrin蛋白表達(dá)量增加（P<0.05），ACTA2蛋白表達(dá)減少（P<0.05）;誘導(dǎo)24小時(shí)后加RLN2培養(yǎng)48小時(shí)抑制的t+48r組與培養(yǎng)24小時(shí)抑制的t+24r組比較E-Cadhrin蛋白表達(dá)無差別（P>0.05），ACTA2蛋白表達(dá)減少（P<0.053）見圖2。

4 討論

目前肺部纖維化中的EMT的調(diào)控機(jī)制尚不完全清楚，TGF-β1是目前確認(rèn)可以引起上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變的因素之一[2]，成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞均可以合成產(chǎn)生TGF-β1并依靠旁分泌和或自分泌的形式調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、遷移，細(xì)胞外基質(zhì)的代謝、組織損傷修復(fù)等。在氣道慢性疾病發(fā)展過程中，長(zhǎng)期反復(fù)的上皮損傷和炎癥刺激會(huì)誘導(dǎo)上皮細(xì)胞及病灶中浸潤(rùn)的炎癥相關(guān)細(xì)胞分泌TGF-β1，TGF-β1受體激活后可抑制細(xì)胞上皮特征的基因表達(dá)，同時(shí)上調(diào)纖維化特異性基因的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞骨架與細(xì)胞黏附分子的功能，促使上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化[8]，最終上皮細(xì)胞失去其上皮表型，例如上皮細(xì)胞E鈣粘素（E-Cadherin）、角蛋白等上皮細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)丟失，并獲得間質(zhì)細(xì)胞的表型特征，例如-平滑肌肌動(dòng)蛋白（ACTA2）等間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)上調(diào)[9]。

松弛素是一類功能廣泛的細(xì)胞因子，隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)RLN具有較強(qiáng)的抗纖維化作用，其抗纖維化可能主要是通過抑制TGF-β1的活性，從而抑制成纖維細(xì)胞的增殖、分化，抑制膠原的合成、分泌和沉積達(dá)到的。目前已有大量的研究證實(shí)RLN在心臟、肝臟等全身多個(gè)器官有廣泛的表達(dá)，并能抑制這些器官的纖維化的進(jìn)展[10]。

本研究開始用不同劑量的松弛素用于TGF-β1對(duì)Bease-2B細(xì)胞的誘導(dǎo)過程，通過對(duì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)上的觀察發(fā)現(xiàn)，10ng/mL的TGF-β1誘導(dǎo)Bease-2B細(xì)胞24h后可觀察到有大量細(xì)胞發(fā)生形態(tài)變化，誘導(dǎo)48h后細(xì)胞明顯向間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)化。在TGF-β1誘導(dǎo)同時(shí)加RLN2 80ng/mL的組抑制細(xì)胞形態(tài)變化最為明顯，本研究分別在加入TGF-β1同時(shí)和加入TGF-β1 24h后加入RLN2，并且分別在RLN2作用達(dá)到24h和達(dá)到48h時(shí)檢測(cè)細(xì)胞的遷移距離以及E-cadhrin、ACTA2兩種細(xì)胞標(biāo)志蛋白的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：各組與TGF-β1組比較遷移能力均較弱，E-Cadhrin表達(dá)量高，ACTA2蛋白的表達(dá)量低，可認(rèn)為80ng/mLRLN2作用24h可以抑制TGF-β1對(duì)上皮細(xì)胞的誘導(dǎo)作用;與同加入TGF-β1和RLN2的組比較，在加入TGF-β1培養(yǎng)24h后再加入RLN2的兩組，遷移能力均較強(qiáng)且E-Cadhrin表達(dá)量較低，ACTA2蛋白的表達(dá)量較高，說明在誘導(dǎo)早期加入的抑制轉(zhuǎn)化效果要高于誘導(dǎo)后期;用RLN2作用48h和作用24h的兩組比較，作用48小時(shí)的組遷移能力略強(qiáng)，ACTA2蛋白的表達(dá)量略減少（P<0.053），但兩組E-Cadhrin的表達(dá)量無差別（P>0.05），說明RLN2對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)上皮轉(zhuǎn)化可能存在一定的時(shí)間依賴性，由于誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)是在細(xì)胞饑餓條件下進(jìn)行的，隨著饑餓培養(yǎng)的時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞耐受力下降，實(shí)驗(yàn)誤差增大，所以對(duì)于RLN2抑制TGF-β1誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的時(shí)間依賴性實(shí)驗(yàn)嘗試尚有待于改良。