鈣鹽及模擬干旱互作對大花套唇苣苔種子萌發和幼苗生長的影響

洪欣 單皖粵 張丹丹 晁天彩 溫放 周守標

摘 要：? ?苦苣苔科原大花旋蒴苣苔（former Boea clarkeana Hemsl.）為我國特有的復蘇植物，在最近的修訂中被并入套唇苣苔屬（Damrongia Kerr），更名為大花套唇苣苔[D. clarkeana （Hemsl.） C. Puglisi]。為了探究該植物對喀斯特特殊生境的適應機制，該文以大花套唇苣苔成熟種子為材料，通過觀察鈣鹽和模擬干旱互作試驗，研究了干旱和鹽脅迫共同作用對其種子萌發和幼苗生長的影響。結果表明：鈣鹽及模擬干旱互作時，低濃度鈣鹽可減輕干旱對種子萌發和幼苗生長的抑制作用，且低程度的干旱與低濃度的鈣鹽相互作用時反而會促進種子萌發和幼苗生長;低鈣鹽低干旱復合條件對大花套唇苣苔生長的促進作用體現了該物種對喀斯特地區保水性差的石灰巖土壤基質的專適性，避免了和其他植物直接生態位的競爭。

關鍵詞：? 大花旋蒴苣苔， 喀斯特地貌， 模擬干旱脅迫， 鈣鹽脅迫， 幼苗生長， 種子萌發

中圖分類號：? ?Q945

文獻標識碼：? ? A

文章編號：? ?1000-3142（2020）10-1457-09

Effects of calcium salt and simulated drought interaction on seed germination and seedling growth of Damrongia clarkeana

HONG Xin1， SHAN Wanyue1， ZHANG Dandan2， CHAO Tiancai2， WEN Fang3，4， ZHOU Shoubiao2*

（ 1. School of Resource and Environmental Engineering， Anhui University， Hefei 230601， China; 2. School of Environmental Science and Engineering， Anhui Normal University， Wuhu 241002， Anhui， China; 3. Guangxi Key Laboratory of Plant Conservation and Restoration Ecology in Karst Terrain， Guangxi Institute of Botany， Guangxi Zhuang Autonomous Region and Chinese Academy of Sciences， Guilin 541006， Guangxi， China; 4. Gesneriad Conservation Center of China （GCCC）， Guilin Botanical Garden， Chinese Academy of Sciences， Guilin 541006， Guangxi， China ）

Abstract：? ?The former Boea clarkeana Hemsl. （Gesneriaceae） is a resurrection plant species endemic to China. In the recent revision， it was incorporated into Damrongia Kerr and renamed as D. clarkeana （Hemsl.） C. Puglisi. In this study， mature seeds of D. clarkeana were used as experimental materials to observe the effects of calcium salt and simulated drought interaction experiments on seed germination and seedling growth in order to explore the adaptation mechanism of the plant to special karst habitats. The results showed that when calcium salt and simulated drought interact， low concentration calcium salt can reduce the inhibition of drought on seed germination and seedling growth， and when low concentration drought interacts with low concentration calcium salt， seed germination and seedling growth will be promoted instead. The promotion effect of low calcium salt and low drought combined conditions on the growth of D. clarkeana also reflects the speciality of the species to limestone soil matrix with poor water retention in karst areas， and also avoids direct niche competition with other plants.

Key words：? Damrongia clarkeana， karst landform， simulated drought stress， calcium salt stress， seedling growth， seed germination

水資源短缺和土壤鹽漬化是目前世界范圍內對作物生產構成威脅的兩種最嚴重的非生物脅迫因子（Guo et al.， 2014），并且還會形成鹽害與干旱的復合脅迫，對植物生長發育、繁殖以及分布產生重要影響（毛海濤等，2016）。隨著世界人口的增長，提高作物的抗鹽、抗旱能力是現代植物育種工作急需解決的關鍵問題之一（Campitelli et al.， 2016; Shaar et al.， 2017）。而對于大多數植物來說，幼苗期則是最為脆弱的時期（Gutterman， 1993）。因此，植物在種子萌發和幼苗生長時期對鹽生和干旱環境的適應能力是決定植物分布范圍和種群生存能力的關鍵因素。華南至西南的喀斯特地區是我國苦苣苔科植物分布的主要生境，該科植物的自然分布具有高度的土壤專一性，大多傾向于分布在喀斯特高鈣土壤中（Hao et al.， 2015）。喀斯特地貌由于基巖裸露率高，土壤淺薄保水性較差，地表蒸發強烈，再加上降水豐富但不穩定，因此即使在雨量較豐富的地區，也會出現“巖溶干旱”現象（Zeng et al.， 2007; Zhou et al.， 2009;梁開明，2010;劉艷，2016）。所以喀斯特生態系統是敏感度高的脆弱生態系統，一旦遭到破壞很難恢復，需要加強人為保護（Mingde，1990;冷疏影和劉燕華，1999;李玉輝，2000）。喀斯特生境中的基巖大多為CaCO3和MgCO3為主的碳酸鹽類，土壤富鈣成為喀斯特土壤最顯著的特征（齊清文，2014）。在高鈣、干旱、貧瘠的喀斯特特殊生境下，促進了植物抗逆性的特化發展，形成了適應喀斯特生境特殊的生理生化與遺傳機制（李陽兵等，2004;Xiao et al.， 2015）。所以研究喀斯特生態系統中典型植物的適應性，對理解喀斯特的植物群落對特殊土壤環境的生理適應機制有重要意義，也對巖溶生態學和恢復生態學的研究方面有重要啟示意義（Hao et al.， 2015）。

大花套唇苣苔（Damrongia clarkeana）曾被當做是旋蒴苣苔屬（Boea Comm. ex Lam.）的一員，修訂前被稱為大花旋蒴苣苔（B. clarkeana），修訂后成為套唇苣苔屬（Damrongia Kerr ）在我國的唯一一個種，主要分布在長江流域中下游的中低海拔喀斯特山地石灰巖裸巖表面和石縫里，分布面積廣，有很強的耐旱性，表現出優異的脫水耐受性，是我國特有的復蘇植物，是不可多得的抗旱遺傳資源，具有重要研究價值（李振宇和王印政，2005;Gechev et al.， 2012; 晁天彩等，2013;Wang et al.， 2018）。喀斯特地區土壤鹽旱往往同時發生，前期的研究大部分表明鈣鹽及模擬干旱互作比單一脅迫對植物損害更大（Slama et al.， 2007; Zhang et al.， 2014; Sun et al.， 2015）。研究中常采用PEG6000模擬干旱脅迫，其中聚乙二醇（PEG）是一種高分子滲透劑，其本身無法穿越細胞壁進入細胞質，故不會引起質壁分離，從而使植物細胞和組織處于類似于干旱的水分脅迫之中（Atree & Fowke， 1993）。朱志國等（2018）對不同產地的大花套唇苣苔種子分別開展不同程度的模擬干旱脅迫和鹽分脅迫的單因子處理，結果表明種子具有一定的耐旱性和耐鹽性。本研究在此基礎上進一步研究干旱和鹽脅迫共同作用對大花套唇苣苔種子萌發和幼苗生長的影響，分析了喀斯特生境高鈣性土壤與植物的抗旱機制之間的相互關系，并討論苦苣苔科植物對石灰巖土壤基質的專性適應性和其分布內部驅動因素。

1 材料與方法

1.1 材料

朱志國等（2018）對于大花套唇苣苔4個居群的抗性研究表明，安徽居群的幼苗對鈣離子脅迫更為敏感，且石臺縣棠溪鄉作為擁有豐富石灰石資源的石灰巖地區，喀斯特地形明顯。故選擇安徽省石臺縣棠溪鄉大花套唇苣苔成熟種子為試驗材料。大花套唇苣苔的成熟種子于2010年10月在安徽省石臺縣棠溪鄉隨機采集。

1.2 方法

1.2.1 處理設計? 采取雙因子正交設計，共20個處理：（1）水分梯度處理，采用PEG6000模擬干旱條件（Michel & Kaufmann， 1973）;干旱脅迫梯度為0（CK）、50、100、150、200 g·L-1 PEG6000。（2）鹽分梯度處理，采用CaCl2濃度模擬鹽脅迫條件;鹽分脅迫梯度為0（CK）、5、10、20 mmol·L-1 CaCl2。

1.2.2 種子萌發和幼苗生長觀察? 采用培養皿紙上發芽床，挑選飽滿均勻的大花套唇苣苔種子，使用蒸餾水清洗3次，將種子有序地放在鋪有兩層濾紙的直徑為9 cm的培養皿中。每個處理100粒種子，重復3次，共計60個處理。在每個培養皿中分別加入等量各梯度的PEG和鹽溶液。在種子萌發過程中，每天用電子天平分析天平（島津AUW120D，京都，日本）稱量發芽皿，補充去離子水至原來的重量，并且每隔7 d更換一次溶液，以保證種子順利發芽和鹽、PEG濃度盡可能不變。然后置于條件為光照強度為250 μmol·m-2·s-1、光照時間為12 L/12 D、溫度為25 ℃的全智能人工氣候植物箱RXZ-1500（江南儀器廠，寧波，中國）內培養。每天在解剖鏡下定時觀察發芽過程，依《農作物種子檢驗規程》（國家技術監督局，1995），有明顯的胚根“露白”認定為發芽。

1.2.3 數據統計分析? 統計種子的初始萌發時間和每日正常發芽的粒數，試驗第10天測定發芽勢，試驗第30天測定根長和苗長，并根據下列公式計算發芽率、發芽勢、萌發指數和活力指數。

發芽率（%）=正常發芽粒數/供試種子總數×100%;

發芽勢（%）=規定日數內發芽的種子數/供試種子數×100%;

萌發指數Gi=∑Gt/Dt （Gt為第t日的萌發數，Dt為相應的萌發日數）;

活力指數Vi=S×∑Gt/Dt （S為幼苗的平均長度）。

數據采用SPSS 16.0軟件進行單因素方差分析，差異顯著用Duncan檢測進行多重分析。

2 結果與分析

2.1 干旱與鹽脅迫對大花套唇苣苔種子萌發勢的影響

測定不同鹽濃度脅迫下的種子發芽情況是測定植物耐鹽性的重要依據之一。植物的種子萌發期比植株生長期更容易遭受鹽害，同時鹽脅迫過程中植物種子萌發情況同植物本身耐鹽性有一定關系（張立軍等，2007）。

不同程度的模擬干旱和鈣鹽脅迫下對大花套唇苣苔種子發芽勢的測定結果：經過10 d的連續觀察統計發現（圖1），當CaCl2濃度為5 mmol·L-1的時候，種子的發芽勢均高于相同PEG濃度下其他CaCl2濃度處理的種子的發芽勢，且在無PEG處理時，發芽勢最高，為44%;而在無干旱處理條件下，10 mmol·L-1 CaCl2的發芽勢也大于CK處理的發芽勢，但隨著PEG濃度的升高，發芽勢出現逐漸下降的趨勢;當PEG濃度達到150、200 g·L-1時，分別與高濃度20 mmol·L-1的CaCl2處理時，大花套唇苣苔種子的發芽勢降為零，而同時低濃度5 mmol·L-1 CaCl2處理的發芽勢卻大于CK。這表明干旱脅迫抑制種子萌發;低濃度的鈣鹽卻可促進種子萌發，并減輕互作時干旱對萌發的抑制作用。

2.2 干旱與鹽脅迫對大花套唇苣苔種子萌發率的影響

一般認為種子的發芽率隨著鹽濃度的提高而下降（顧振新等，2002），但在不同干旱脅迫和鈣鹽脅迫下對大花套唇苣苔種子發芽率測定結果：經過30 d的連續觀察統計發現（圖2），隨著PEG濃度升高，發芽率均逐漸降低;當CaCl2濃度為5 mmol·L-1，PEG濃度為0時，大花套唇苣苔種子的發芽率最高，且當CaCl2濃度為較低濃度時，種子的萌發率均高于相同PEG濃度下的CaCl2較高濃度處理的種子的萌發率;隨著PEG濃度升高，10 mmol·L-1 CaCl2處理的種子萌發率比CK處理的種子的萌發率相比先升高后降低。這表明：干旱脅迫能抑制大花套唇苣苔種子的萌發;適度鈣鹽促進種子萌發;二者互作時，低濃度的CaCl2可以減輕PEG對種子萌發帶來的抑制作用，從而提高大花套唇苣苔的萌發率;但是隨著CaCl2濃度和PEG濃度的不斷升高，兩者互作會協同抑制大花套唇苣苔種子萌發。

2.3 干旱與鹽脅迫對大花套唇苣苔種子初始萌發時間的影響

由圖3可以看出，隨著PEG濃度的升高，種子萌發時間逐漸被推遲。在不同程度的干旱脅迫中，當CaCl2濃度為5 mmol·L-1時，大花套唇苣苔種子的初始萌發時間最早;CaCl2濃度為20 mmol·L-1時，初始萌發時間最長;當PEG濃度為0、50、200 g·L-1時，CaCl2濃度為0、10 mmol·L-1的初始萌發時間相同，PEG濃度為100、150 g·L-1時，10 mmol·L-1CaCl2處理比0 mmol·L-1 CaCl2處理的種子提前萌發。這表明，干旱脅迫會抑制大花套唇苣苔種子的萌發;低濃度鹽分可以縮短種子萌發所需要的準備期并減弱干旱脅迫的抑制作用，促進不同干旱處理的大花套唇苣苔種子提前萌發;20 mmol·L-1 CaCl2與PEG互作則延長了種子萌發的準備期。

2.4 干旱與鹽脅迫對大花套唇苣苔種子萌發指數的影響

由圖4可見，隨著PEG濃度的升高萌發指數呈逐漸下降的趨勢，但是低濃度CaCl2同時作用下，大花套唇苣苔種子的萌發指數較高，并且高于無CaCl2處理的CK處理。在濃度低于200 g·L-1PEG干旱處理下，無CaCl2處理和10 mmol·L-1CaCl2處理的萌發指數相近，僅在高濃度200 g·L-1PEG作用時，10 mmol·L-1CaCl2低于無CaCl2處理的種子萌發指數。高濃度20 mmol·L-1 CaCl2與干旱互作時，種子萌發指數顯著降低。所以，干旱可以顯著降低大花套唇苣苔種子的萌發指數;但是低于10 mmol·L-1濃度的鹽脅迫可以適當降低低濃度干旱脅迫帶來的影響，從而提高大花套唇苣苔種子的萌發指數;而鹽脅迫與高濃度PEG互作時會增強其抑制作用。

2.5干旱與鹽脅迫對大花套唇苣苔種子活力的影響

由圖5可見，無CaCl2處理組比有CaCl2處理組的大花套唇苣苔種子活力指數更高;無CaCl2處理時，隨著PEG濃度的升高，活力指數先上升后顯著下降，且在較輕干旱處理PEG濃度為50 g·L-1時活力指數達到最大。無干旱處理時，0、5 mmol·L-1的CaCl2處理下的活力指數基本相同;鈣鹽及模擬干旱互作時，活力指數總體隨著PEG濃度的升高呈逐漸下降的趨勢;當高濃度PEG干旱脅迫和高濃度CaCl2相互作用時，大花套唇苣苔種子的活力指數降為0。所以，輕度單一干旱脅迫能提高其活力指數;低濃度鈣鹽處理與干旱互作時對大花套唇苣苔種子的活力指數會降低，但影響較小;高鹽處理和重度干旱互作則顯著降低其活力指數。

2.6 干旱與鹽脅迫對大花套唇苣苔幼苗胚根根長的影響

對鹽旱不同濃度處理條件下大花套唇苣苔胚根根長統計結果顯示（圖6），鹽處理組的根長都顯著低于相同PEG處理下的無鹽處理組。CaCl2濃度為0、5 mmol·L-1時，隨著PEG濃度的升高，根的長度先上升，后逐漸下降;CaCl2濃度為10、20 mmol·L-1時，根長隨著PEG濃度的升高逐漸下降。鹽脅迫對于大花套唇苣苔胚根的伸長有抑制作用，且會逐漸抵消輕度干旱對根伸長的促進作用，而隨著PEG濃度增大二者會協同抑制胚根伸長，但輕度鈣鹽及模擬干旱互作仍會促進胚根伸長。

2.7 干旱與鹽脅迫對大花套唇苣苔幼苗苗長的影響

從圖7可以看出，隨著PEG濃度的升高，大花套唇苣苔幼苗的苗長變化不顯著，只有在CaCl2濃度為20 mmol·L-1，PEG濃度為150、200 g·L-1時，由于種子只初露胚根，因而苗長為0，所以可推測PEG對幼苗生長影響不大;同時有鹽處理組的苗長都低于無鹽處理組，故鹽濃度對于大花套唇苣苔幼苗苗長的生長有輕微抑制作用，不如其對根生長抑制作用顯著;輕度鹽脅迫與輕度干旱脅迫互作可抵消鹽脅迫抑制作用并協同促進幼苗生長，高鹽處理和重度干旱互作則顯著抑制幼苗生長。

3 討論與結論

干旱引起的滲透脅迫對植物生長發育具有很大影響（Zhang et al.， 2004），而鹽分對種子萌發和幼苗生長的影響是由滲透效應以及離子毒害作用共同影響的（Levit， 1980; Munns & Tester， 2008;高潤昕等，2019）。通過試驗結果可得，干旱脅迫與鹽脅迫及二者互作對大花套唇苣苔種子萌發及幼苗生長均有一定影響。單獨作用時，干旱脅迫主要抑制了大花套唇苣苔種子萌發，而鹽脅迫則主要抑制幼苗根的伸長。

在我們研究中發現鈣鹽及模擬干旱互作時，低濃度鈣鹽卻可減輕PEG模擬干旱對種子萌發和幼苗生長的抑制作用，同時還加快了種子萌發速率。與單一鹽、旱脅迫相比，適度的鈣鹽及模擬干旱互作促進了種子萌發速率和幼苗胚根的生長，表明植物對于雙重脅迫可表現出一定的適應性（解衛海等，2015;Hussainl et al.， 2016）。這可能是由于適度的鈣鹽脅迫和干旱脅迫單獨作用時皆可一定程度地提高大花套唇苣苔抗逆性，當二者互作時，植物體內的生理機制能夠協同調節植物生長，增加其抗逆境能力，從而使得植物在鹽旱復合脅迫下增強了其滲透調節能力和吸水性（Fahad et al.， 2014; Liu et al.， 2014;翁亞偉等，2016）。

具體來說，種子開始萌發的時間隨著干旱脅迫加劇而逐漸延長，但輕度的干旱脅迫可促進幼苗胚根的生長。這可能是由于種子為了抵抗干旱脅迫，延長了種子萌發的準備期，需要積累一定水分后才能萌發，這種萌發機制大大降低了植物在干旱區生存的風險（呂美婷等，2010）;積累足夠養分達到萌發條件后，種子開始萌發生根，各項代謝活動增強，同時輕度干旱脅迫使植物對水分需求提高，為了滿足代謝活動和生長發育需求，胚根需要繼續伸長以獲得更多水分（Brunner et al.， 2015）。且前期研究也表明一定程度的干旱會使其體內脯氨酸和可溶性糖等含量增加，增加了植物的抗性，但重度脅迫時由于分解代謝大于合成代謝導致脯氨酸和可溶性糖含量下降從而抑制生長（張丹丹等，2016;Yang et al.， 2020）。同時有研究表明（Wang et al.， 2018），大花套唇苣苔擁有非常豐富的耐旱修復和抗逆基因，體現了對其特殊生境的適應性。喀斯特地貌很容易出現“巖溶干旱”和石漠化現象，這種特殊干旱生境下植物種子能否保持活力及幼苗能否繼續生長是植物存活的關鍵（秦文靜和梁宗鎖，2010），同時也會影響到植物的分布。而縱觀大部分苦苣苔科植物往往生長在洞穴中或者溪流、瀑布向北的潮濕的苔蘚石壁上（韋毅剛等，2010），而大花套唇苣苔卻大多分布在土層淺薄、保水性差的裸露石灰巖表面和石縫里（晁天彩等，2013），其種子和幼苗這種對干旱脅迫的適應機制使其能夠更好地適應喀斯特干旱地貌。

單獨鹽脅迫結果也同時表明一定程度的鈣鹽脅迫并不會顯著影響大花套唇苣苔種子的萌發率，只有在較高濃度的鈣鹽脅迫才會影響苗的存活。大花套唇苣苔傾向分布在喀斯特特殊的高鈣土壤中，具有較強的鈣富集能力，一方面可將外源鈣離子轉化為自身結構儲存起來，體內鈣的形態大部分是以果膠酸鈣的形式存在于細胞壁和細胞器中，增強細胞的穩定性，更好地適應逆境（Hepler & Winship， 2010;朱志國等，2015;張丹丹，2015）;另一方面可控制植物對鈣離子的吸收轉運，維持體內正常鈣含量，體現了植物對環境的適應性（姬飛騰等，2009）。鈣作為植物必需的營養元素之一，不僅在植物生理代謝過程中起著重要的作用，還作為偶連植物胞外信號與胞內代謝的“第二信使”參與細胞信號轉導的抗逆應答過程（Brownlee， 2003），對植物生理功能有著重要影響。研究表明，在植物面臨鹽害、干旱及氧化等環境脅迫時，細胞質中Ga+濃度增加，同時產生鈣信號，啟動基因表達抵抗外界環境脅迫，調節代謝過程和生長發育，提高植物對干旱等逆境的適應性，在植物逆境信號轉導中發揮著重要作用（Hetherngton & Brownlee， 2004; Lecourieux et al.， 2006）。同時可溶性碳酸鹽可與土壤腐殖質凝聚結合成穩定的腐殖酸鈣，有利于土壤有機質的積累和植物的生根，具有保水、保護作用（李艷瓊等，2016）。但高濃度鈣鹽也是一種細胞毒害劑，會影響植物的正常生理功能。

種子萌發和萌發苗的早期生長，基本依靠種子的貯藏物質（張穎娟等，2008），所以種子萌發中對不可預測的環境變化的適應，是植物種子在惡劣環境中萌發的關鍵（黃振英等，2001）。本研究中，高鈣環境不僅僅可以抵消干旱對大花套唇苣苔的影響，還可以加快大花套唇苣苔種子萌發速率，可以進一步加大種子萌發和幼苗生長時期對喀斯特環境的適應能力。結果還進一步表明雖然不同鹽濃度脅迫對幼苗根長的影響要大于對幼苗苗長的影響，表明幼根對鹽脅迫更加敏感，這與齊清文等（2014）高鈣處理對報春苣苔屬植物根系系統的影響結果一致。但是，輕度干旱可減弱鈣鹽處理的抑制作用，反而促進其生長。這種生存機制對于生長在干旱的石灰巖表面上，并能在失水條件下存活的大花套唇苣苔來說非常重要。同時，前期我們對其野外調查和遺傳多樣性的研究表明，相同條件下它對其他植物的競爭力較弱（溫放和李湛東，2006）。所以，大花套唇苣苔憑借種子萌發過程中對滲透效應與離子效應的綜合適應（Fercha & Azzedine， 2014），完美適應了其他植物種子無法萌發和生長的石灰巖極度干旱的表面，避免和其他植物直接生態位的競爭。

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（ 責任編輯 李 莉 ）