基質金屬蛋白酶?9及金屬蛋白酶組織抑制劑1在呼吸道合胞病毒毛細支氣管炎進展為哮喘中的意義

康平 孫曉敏 趙少聰 馮一川 李奕

鄭州大學附屬兒童醫院1呼吸科，2普內科，3檢驗科，4過敏原治療室（鄭州450000）

70%以上的毛細支氣管炎（以下簡稱毛支）是由呼吸道合胞病毒（RSV）感染引起的［1］。臨床研究證實，嬰幼兒時期RSV毛支與兒童時期支氣管哮喘的發生密切相關［2-3］，需及早干預以改善預后［4］。臨床目前尚缺乏預測毛支進展性哮喘發生的有效指標。基質金屬蛋白酶9（matrix metallopro?teinase?9，MMP?9）及其組織抑制劑（tissue inhibitor of metalloproteinase?1，TIMP?1）是參與呼吸道炎癥、哮喘氣道高反應性的細胞因子之一［5］，被認為是RSV毛支病情評估的潛在標志物［6-7］。然而，目前關于MMP?9、TIMP?1及二者平衡狀態與RSV毛支發展為哮喘的關系尚未見報道。本研究旨在探討RSV毛支患兒外周血中MMP?9和TIMP?1水平在其發展為哮喘中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2015年6月至2017年6月本院收治的RSV毛支患兒300例（RSV組）。納入標準：（1）癥狀、體征和相關輔助檢查符合《諸福棠實用兒科學》中毛細支氣管炎診斷標準［8］，經咽拭子或鼻咽部抽吸等呼吸道分泌物病原學檢測明確為RSV感染；（2）30 d～1周歲；（3）首次感染和發病；（4）臨床及病史資料完整。排除標準：（1）合并有其他病原體感染；（2）繼發于肺結核等肺部感染；（3）合并心腦血管疾病、自身免疫性疾病、肝腎功能障礙；（4）早產兒（胎齡36周）；（5）入組前1個月內使用糖皮質激素。收集同期健康體檢幼兒200例為對照組，年齡42 d～1周歲。本研究經鄭州大學附屬兒童醫院倫理委員會批準，相關研究獲得受試者家屬知情同意。

1.2 臨床資料及分組統計研究對象的一般臨床資料，包括年齡、性別、過敏史、家族過敏性疾病史、父母吸煙史以及咳嗽、氣促、喘息、心動過速、三凹征和發紺等臨床查體癥狀。輔助檢查包括呼吸頻率、血氧飽和度等。參照RSV毛細支氣管炎評分標準（呼吸評分法）對RSV毛細支氣管炎患兒進行病情評估［9］。從入組開始對RSV毛細支氣管炎患兒進行隨訪，根據中華醫學會兒科學分會呼吸學組制定的診斷標準［10］將RSV毛細支氣管炎患兒分為非哮喘組和哮喘組，隨訪截止至2019年12月。

1.3 實驗室指標采集所有研究對象入組時指腹血3 mL，全自動生化分析儀檢測血常規指標，觀察白細胞計數（white blood cell，WBC）、中性粒細胞計數（neutrophil count，NEUC）及比例、淋巴細胞計數（lymphocyte count，LMC）及比例；放射免疫法測定C反應蛋白（C reactive protein，CRP）；酶聯免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測血清中MMP?9和TIMP?1的含量并計算二者比值：血液樣本于非抗凝管中靜置2 h，3 000 r/min離心30 min后取上清，按照試劑盒（北京Solarbio科技有限公司）說明書進行操作。

1.4 統計學方法應用SPSS 19.0進行統計學分析。計量資料組間比較行獨立樣本t檢驗；計數資料組間比較行χ2檢驗；采用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic，ROC）分析MMP?9、TIMP?1和MMP?9/TIMP?1對RSV毛支診斷及其發展為哮喘的預測價值；logistic多因素回歸分析影響RSV毛支發展為哮喘的危險因素。當P ＜0.05時認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RSV 組與對照組一般及臨床資料比較RSV組NEUT及比例、LMC及比例、CRP顯著高于對照組（P ＜0.05）；RSV組血清MMP?9、TIMP?1水平和MMP?9/TIMP?1均顯著高于對照組（P ＜0.05），見表1。

2.2 MMP-9、TIMP-1 及MMP-9/TIMP-1 與RSV毛支相關性分析以RSV組和對照組作為分類變量進行ROC曲線分析顯示，血清MMP?9、TIMP?1和MMP?9/TIMP?1診斷RSV毛支的曲線下面積（AUC）分別為0.942、0.579、0.827，最佳截斷值分別為1 705.9、115.75 ng/mL和6.57，特異性分別為86.7%、93.0%、91.0%，敏感性分別為90.0%、21.5%、71.0%。見圖1。

相關性分析顯示，RSV毛細支氣管炎患兒MMP?9與臨床評分呈正相關；MMP?9/TIMP?1與臨床評分及LMC均呈正相關，與NEUT呈負相關（P ＜0.05），提示其與病情嚴重程度相關。見表2。

2.3 血清MMP-9、TIMP-1 及MMP-9/TIMP-1 與RSV毛支發展為哮喘的關系300例RSV組毛支患兒的隨訪結果發現，共88例（29.33%）患兒發展為哮喘。比較哮喘組和非哮喘組一般及實驗室資料，兩組在年齡、接觸過敏原、家族過敏史、LMC、呼吸頻率、臨床評分等指標上差異有統計學意義（P ＜0.05），且哮喘組MMP?9水平及MMP?9/TIMP?1比值均顯著高于非哮喘組（P ＜0.05）。見表3。ROC曲線分析顯示，血清MMP?9、TIMP?1及MMP?9/TIMP?1診斷RSV毛支發展為哮喘的曲線下面積分別為0.612、0.547、0.708，特異性分別為86.3%、75.5%、90.6%，敏感性分別為37.5%、37.5%、61.4%。最佳截斷值分別為3 733.7、190.3 ng/mL和14.56。見圖2。

表1 RSV 組與對照組一般及臨床資料比較Tab.1 Comparison of general and clinical data between RSV group and control group±s

表1 RSV 組與對照組一般及臨床資料比較Tab.1 Comparison of general and clinical data between RSV group and control group±s

對照組RSV組t/χ2值P值年齡（d）男［例（%）］接觸過敏原［例（%）］家族過敏史［例（%）］父母吸煙［例（%）］WBC（×109/L）NEUT（×109/L）NEUT比例（%）LMC（×109/L）LMC比例（%）CRP（mg/L）氧飽和度（%）呼吸頻率（次/min）MMP?9（ng/mL）TIMP?1（ng/mL）MMP?9/TIMP?1（n=200）176.9±89.1 113（56.50）43（21.50）49（24.50）83（41.50）8.74±1.21 4.74±1.04 54.3±9.7 3.13±0.91 35.8±9.8 4.56±1.65 96.4±1.3 45.0±7.4 1 115.6±528.0 249.7±132.4 6.1±5.1（n=300）183.1±74.5 187（62.33）49（16.33）55（18.33）120（47.67）8.82±1.79 3.45±1.99 37.7±17.9 4.9±1.49 52.3±17.9 4.93±1.14 96.2±1.3 45.3±7.3 2 776.3±944.9 284.0±131.4 11.4±6.1 0.811 1.701 2.134 2.770 0.112 0.594 9.465 13.375 15.599 13.283 2.762 1.442 0.305 22.609 2.847 10.178 0.418 0.192 0.144 0.096 0.738 0.553＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001 0.003 0.150 0.760＜0.001 0.005＜0.001

圖1 MMP?9、TIMP?1 及MMP?9/TIMP?1 診斷RSV 毛支的ROC 曲線Fig.1 ROC curves of MMP?9，TIMP?1 and MMP?9/TIMP?1 in diagnosing RSV bronchiolitis

2.4 RSV 毛支發展為哮喘的危險因素分析以是否發展為哮喘為因變量，納入表3中P ＜0.05的指標為自變量進行多因素logistic回歸分析。結果顯示，家族過敏史、臨床評分、MMP9及MMP?9/TIMP?1是RSV毛支向哮喘發展的危險因素，而發病年齡是其保護因素（P ＜0.05）。見表4。

3 討論

約30% RSV毛支可發展為哮喘，嚴重者可出現肺部病變甚至心力衰竭［11］。該致病機制尚不明確，目前認為與炎癥反應及過度免疫有關。MMPs是降解細胞外基質（ECM）的重要酶類，參與組織重建、修復、血管形成及炎癥反應等多種病理生理過程［12］。TIMP?1是MMPs的特異性抑制因子，二者共同參與多種呼吸道氣道重塑相關疾病［13］。此外，MMP?9和TIMP?1作為一對互為抑制的分子，二者的平衡在疾病中具有重要意義。NAVRATI?LOVA等［14］研究發現，慢性阻塞性肺病（COPD）患者中存在MMP?9及TIMP?1濃度的顯著升高，且患者可能在肺局部及全身水平上存在MMP/TIMP的失衡和紊亂。GILOWSKA等［15］研究也顯示，COPD患者血清MMP?9和MMP?9/TIMP1水平顯著高于對照組，且隨著患者肺功能的下降逐漸升高。ZHOU等［16］研究顯示，MMP?9/TIMP?1比值的升高與患者的肺功能呈顯著負相關關系。有研究顯示，COPD患者肺血管中存在MMP?9的高表達，且可以介導TLR?4的炎癥反應以影響肺血管重塑［17］。然而，MMP?9和TIMP?1在毛支患兒中的表達情況及意義尚不明確。BRAND等［18］的一項前瞻性研究表明，病毒性呼吸道感染兒童血液和鼻咽標本中MMP?9的表達水平與疾病的嚴重性相關，可作為病毒性呼吸道感染疾病嚴重程度的潛在標志物。本研究發現，與對照組相比，RSV毛支患兒血清MMP?9、TIMP?1水平及MMP?9/TIMP?1明顯升高，且MMP?9/TIMP?1與RSV毛支患兒病情嚴重程度呈明顯正相關，提示其可能與RSV毛支的發病及進展相關。

表2 MMP?9、TIMP?1 及MMP?9/TIMP?1 與臨床評分及血常規指標相關性Tab.2 Correlation of MMP?9，TIMP?1 and MMP?9/TIMP?1 with clinical scores and blood routine indicators

表3 哮喘組與非哮喘組一般及臨床資料比較Tab.3 Comparison of general and clinical data between asthma group and non?asthma group ±s

表3 哮喘組與非哮喘組一般及臨床資料比較Tab.3 Comparison of general and clinical data between asthma group and non?asthma group ±s

年齡（d）性別（男/女）接觸過敏原［例（%）］家族過敏史［例（%）］父母吸煙［例（%）］WBC（×109/L）NEUT（×109/L）NEUT比例（%）LMC（×109/L）LMC比例（%）CRP（mg/L）氧飽和度（%）呼吸頻率（次/min）臨床評分（分）MMP?9（ng/mL）TIMP?1（ng/mL）MMP?9/TIMP?1非哮喘組（n=212）190.9±71.9 133/79 28（13.2）29（13.7）78（36.8）8.76±1.78 3.53±1.96 38.7±17.5 4.36±1.42 51.32±17.53 1.90±1.17 96.20±1.36 44.85±7.14 2.38±0.80 2 747±953 290.3±128.9 10.7±4.9哮喘組（n=88）164.3±77.7 54/34 21（23.9）26（29.5）42（47.7）8.98±1.80 3.28±2.06 35.2±18.7 4.81±1.61 54.81±18.66 1.99±1.06 96.18±1.31 46.41±7.39 3.07±0.92 3 334±1445 268.7±136.9 14.5±5.8 t/χ2值2.858 0.050 5.167 10.456 3.098 0.989 0.994 1.541 2.291 1.541 0.610 0.123 1.706 6.153 3.504 1.297 5.473 P值0.005 0.823 0.023 0.001 0.078 0.323 0.321 0.124 0.023 0.124 0.543 0.902 0.089＜0.001 0.001 0.196＜0.001

圖2 MMP?9、TIMP?1 及MMP?9/TIMP?1 預測RSV 毛支進展為哮喘的ROC 曲線Fig.2 ROC curves of MMP?9，TIMP?1 and MMP?9/TIMP?1 predicting the progression of RSV bronchiolitis to asthma

表4 RSV 毛細支氣管炎發展為哮喘的logistic 回歸分析Tab.4 Logistic regression analysis of RSV bronchiolitis progressing to asthma

現有研究表明，MMP?9與TIMP?1共同參與細胞外基質的降解從而影響哮喘發生的關鍵環節——支氣管組織破壞和修復［19］。NAIK等［20］發現哮喘患者誘導痰液中MMP?9水平顯著高于對照組，提示MMP?9與哮喘的發生有關；CHAUHAN等［21］發現在慢性哮喘患者中，MMP?9及TIMP?1活性均隨著氣道炎癥和肺纖維化的進展而升高，隨其緩解而降低。GRZELA等［22］研究認為MMP?9在哮喘的病理機制中發揮了重要作用，對MMP?9抑制的研究有望成為提高哮喘治療效果的新視角。本研究結果顯示，發展為哮喘的RSV毛支患兒血清MMP?9水平及MMP?9/TIMP?1明顯高于非哮喘組，提示該指標可能對RSV毛支向哮喘轉化具有一定預測效能，與現有結論基本一致。此外，MMP?9/TIMP?1與RSV患兒的淋巴細胞及中性粒細胞水平密切相關，提示其可能還參與患兒的炎癥及免疫反應過程。因此可以推測，RSV感染誘發哮喘的機制之一可能在于感染誘導氣道內炎性因子釋放，激活機體免疫反應的同時進一步誘導氣道上皮細胞外基質降解，導致氣道黏膜上皮完整性的破壞以及嚴重時哮喘的發生，因此，表征胞外基質降解水平的MMP?9/TIMP?1指標可以對哮喘的發生起到預警作用。此外，本研究結果還顯示，年齡依賴的免疫能力、遺傳因素、個體特應性體質及首次發病的嚴重程度等均是毛支患兒發展為哮喘的影響因素，與現有研究［23］一致。

綜上所述，本研究認為RSV毛支患兒血清MMP?9、TIMP?1水平和MMP?9/TIMP?1與病情嚴重程度有關，且MMP9及MMP?9/TIMP?1可能是RSV毛支發展為哮喘的預后因素，可以作為RSV毛支患兒臨床診療的參考指標。