循環miRNA作為癲癇診斷潛在生物標志物的研究進展

趙海燕，黃穎綜述 李永男審校

癲癇是一種常見的危害性極大并且發病機制尚不明確的慢性神經系統疾病，其特征是不可預測性的癲癇發作。由于其致殘率高、臨床反復發作和病程漫長，嚴重影響患者的身心健康并且給社會帶來經濟負擔。近年來，通過對循環miRNA表達譜的研究，在癲癇患者和癲癇動物模型中已確定存在100多種不同miRNAs的表達變化，并有證據表明癲癇與循環miRNAs表達變化有關。本文就癲癇患者或癲癇動物模型中差異性表達的循環miRNA及其與癲癇的相關性進行綜述。

1 癲癇診療現狀

全世界癲癇患者有6 500萬人，約占世界人口的1%～2%[1-2]。目前，其診斷主要依賴于病史和臨床輔助檢查[3]，而輔助檢查中除在癲癇監測單元中進行長時程動態腦電圖外，其他類型的腦電圖檢測率有限，許多癲癇患者的腦部影像學檢查為陰性[4]。目前，大部分癲癇患者經過正規的抗癲癇藥物治療可有效控制，但仍有部分患者不能完全控制，其主要因素之一是癲癇病因的復雜性及異質性。隨著2015年精準醫學概念的提出，越來越多的學者開始關注如何能做到疾病的精確診斷和靶向治療。因此，找出有效的生物標志物將有助于對癲癇作出快速正確的診斷和分類，同時為開發癲癇靶向藥物治療提供理論基礎。

2 循環miRNA作為癲癇潛在生物標志物

2.1 循環miRNA MicroRNA(miRNA)是內源性18～23個堿基的小片段非編碼RNA，作為基因表達的轉錄后調節因子，主要通過與其靶基因mRNA的3’非翻譯區結合，使目標mRNA降解或抑制其翻譯，從而實現轉錄后水平調控基因表達，參與調控個體發育、細胞增殖及分化、細胞死亡、代謝等生物學過程，在基本生命活動中發揮重要作用[5]。存在于血液、尿液、唾液、精液、淚液、乳汁及羊水等體液中的一類miRNA統稱為循環miRNA[6]。近年來，循環miRNA因其具有穩定、易檢測、經濟及無創等特點而備受關注，已成為許多疾病的新型診斷工具[7]。

2.2 循環miRNA作為癲癇潛在生物標志物 在腦組織中，特定細胞類型表達特定的miRNA，這些miRNA是維持其生理特性和細胞骨架所必需的。已發現miRNA在神經元、星形膠質細胞、小膠質細胞和少突膠質細胞中富集或獨特表達[8-9]。合成miRNA關鍵酶的缺失可導致腦組織結構和功能上的巨大變化，從而導致神經變性和反復癇性發作(即癲癇)的發生，即使一種miRNA的缺失也足以產生明顯的中樞神經系統疾病表型[10]。研究發現，在癲癇患者腦組織和癲癇動物模型中發生miRNA表達變化，并且這些變化也可以在循環中檢測到[11]。這些研究結果為在miRNA水平對癲癇的診斷和治療開辟了新的途徑，也為癲癇患者的靶向治療帶來新的希望。目前，對癲癇相關miRNA的研究主要是對差異性表達的循環miRNA進行篩選。然而，這些差異性表達的循環miRNA在癲癇的發生和發展的機制尚不十分明確。

3 循環miRNAs表達與癲癇的相關性研究

3.1 miR-134 研究表明，miR-134在大腦中豐富表達，可定位于神經元樹突，并負向調節樹突棘的大小[12]。Avansini等[13]通過對顳葉內側癲癇(mesial temporallobe epilepsy，MTLE)14例、局灶性皮質發育不良(focal cortical dysplasia，FCD)13例和正常對照16例的血漿miRNA進行高通量測序分析發現，與正常對照組相比，hsa-miR-134在MTLE患者血漿中顯著下調，而在FCD患者血漿中沒有下調。為了進一步評估hsa-miR-134作為MTLE生物標志物的穩定性，應用實時定量PCR法驗證了65例MTLE患者和83例對照組的獨立隊列證實，與對照組相比，MTLE患者血漿中hsa-miR-134顯著下調。因此，hsa-miR-134的表達下調或是MTLE一種潛在的非侵入性生物標志物。最近的研究表明[14]，通過側腦室注入紅藻氨酸(kainic acid，KA)誘導的癲癇持續狀態(status epilepticus，SE)大鼠模型中，miR-134的表達在大鼠海馬中顯著上調。而應用miR-134拮抗劑后，不僅減少癲癇發作，并且抑制癲癇損傷所誘導的內質網應激和凋亡相關的CHOP、Bim和細胞色素C的表達，還促進海馬中環磷腺苷效應元件結合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)的表達。TUNEL和Nissl染色分析亦顯示，沉默miR-134的表達，可抑制癲癇所誘導的海馬CA3區錐體神經元凋亡及苔蘚纖維的異常發芽。在戊四唑(pentylenetetrazol，PTZ)癲癇模型、穿孔途徑刺激(perforant pathway stimulation，PPS)癲癇模型等多種顳葉癲癇模型中，沉默miR-134均可起到有效的抗癲癇作用[15-17]。這些研究結果表明，miR-134可能是有效的顳葉癲癇診斷標志物，而抑制其表達是治療顳葉癲癇的干預措施。

3.2 miR-301a-3p Wang等[18]使用Illumina HiSeq 2000測序發現，30例耐藥性患者和30例非耐藥性癲癇患者之間血清miRNA存在差異性表達。然后，通過實時定量PCR法在77例耐藥性癲癇患者、81例非耐藥性癲癇患者和85例健康對照者中驗證所選擇的miRNA。發現與非耐藥性癲癇組和健康對照組相比，耐藥性癲癇組血清miR-194-5p、miR-301a-3p、miR-30b-5p、miR-342-5p和miR-4446-3p表達顯著下調。其中，miR-301a-3p是鑒別耐藥性癲癇和非耐藥性最有價值的生物標志物。多元回歸分析顯示，miR-301a是耐藥癲癇診斷的潛在生物標志物，其敏感度為80.5%，特異度為81.2%，且其表達水平下調與癲癇發作的嚴重程度呈負相關。這一結果表明，血清miR-301a-3p或成為耐藥性癲癇診斷的潛在生物標志物。

3.3 miR-106b及miR-146a Wang等[19]使用Illumina HiSeq2000測序篩選30例癲癇患者和30例健康對照組血清中差異性表達的miRNAs。然后，通過實時定量PCR對117例癲癇患者和112例健康對照者中進行驗證。發現與對照組相比，癲癇患者血清miR-7d-5p、miR-106b-5p、miR-130a-3p和miR-146a-5p表達上調，而miR-15a-5p和miR-194-5p表達下調。其中，miR-106b-5p對癲癇的診斷價值最高，其敏感度為80.3%，特異度為81.2%。這一結果提示，miR-106b-5p可作為癲癇新的無創性診斷生物標志物。An等[20]招募了90例癲癇患者(其中，57例為全身性癲癇發作，33例為局灶性癲癇發作)和90例健康對照者，通過PCR方法檢測了癲癇患者和對照組血清中4種與癲癇相關miRNAs，即miR-106b、miR-146a、miR-194-5p和miR-301a的表達水平。發現與對照組相比，癲癇組血清miR-106b、miR-146a和miR-301a顯著上調，而miR-194-5p顯著下調。進一步研究發現，血清miR-106b和miR-146a的表達上調水平與癲癇發作嚴重程度呈正相關，且在血清中兩者聯合檢測對癲癇的預測具有更好的敏感度和特異度。這些研究表明，血清miR-106b及miR-146a可以作為診斷癲癇和評估其嚴重程度的潛在生物標志物。

3.4 miR-129-2-3p Sun等[21]研究難治性顳葉癲癇(temporal lobe epilepsy，TLE)患者的顳葉皮質組織與血漿中所表達miRNA的相關性，首先，在手術中切除致癇灶的9例難治性TLE患者的顳葉皮質和8例因高血壓顳葉出血而行腦出血清創術所獲得的顳葉皮質中，使用Affymetrix miRNA 4.0微陣列法篩選出差異性表達的miRNAs；然后，應用實時定量PCR方法，在13例難治性TLE患者(包括9例用于微陣列篩選的患者)和13例無癲癇發作史及抗癲癇藥物接觸史的對照者(高血壓顳葉出血而行腦出血清創術的患者作對照)的顳葉皮質腦組織中驗證所選的差異性表達miRNAs；最后，再通過實時定量PCR檢測來自25例難治性TLE患者和25例對照者血漿樣品中所選miRNAs的表達水平。結果顯示，miR-129-2-3p在難治性TLE患者的顳葉皮質組織和血漿中均表達上調，且隨癲癇發作頻率的增加，血漿中miRNA-129-2-3p的表達水平也上調，癲癇患者的預后亦差。因此，血漿miRNA-129-2-3p或作為潛在的非侵入性生物標志物，可用于難治性TLE的早期檢測和臨床預后評估。

3.5 miR-145 研究表明，在SH-SY5Y細胞水平miR-145表達增高，可誘導BCL2相互作用蛋白3(Bnip3)的轉錄和表達，引起caspase-3和caspase-9蛋白表達增多，進而線粒體自噬受抑制，最終導致SH-SY5Y細胞凋亡[22]。Shen等[23]通過實時定量PCR分析，40例難治性顳葉癲癇患者和42例健康對照者血漿中的miR-145-5p表達水平，發現miR-145-5p在難治性顳葉癲癇患者血漿中的表達明顯下調，而且其表達的降低程度與癲癇患者的發病年齡、癲癇發作頻率呈正相關。此項研究表明，血漿miR-145-5p可作為難治性顳葉癲癇早期檢測和臨床評估的潛在非侵入性生物標志物。

3.6 miR-141 近年來，由于miR-141家族具有誘導神經腫瘤細胞凋亡的特點，而作為抑癌基因受廣泛關注[24]。在許多癌癥中，miR-141的表達水平下調，影響腫瘤細胞凋亡、衰老、增殖和浸潤[25]。Liu等[26]通過微陣列分析和實時定量PCR方法，檢測皮下注射KA制作的SE小鼠模型血清中miR-141表達水平，發現與正常對照組相比，SE組小鼠血清中miR-141顯著上調。在體外細胞癲癇模型中顯示，過表達的miR-141可促進caspase-3、caspase-9、Bax及p53蛋白表達和降低細胞沉默調節蛋白1(silent information regulator 1，SIRT1)的表達，并誘導細胞凋亡、抑制細胞增殖；而應用miR-141拮抗劑則引起與此相反的效果。這一研究結果表明，通過對miR-141在癲癇動物模型中表達水平的變化及其所誘導細胞凋亡通路的進一步探索，血清miR-141或作為癲癇診斷和治療的生物標志物。

3.7 miR-30a 為了探究癲癇患者在癲癇發作期與癲癇發作間期循環miRNAs的表達差異，Sun等對3例癲癇患者分別在癲癇發作期和發作間期收集血清用于miRNAs表達譜分析。結果顯示，與癲癇發作間期相比，在癲癇發作期患者血清中15個miRNA表達上調，10個miRNA表達下調。然后，在90例癲癇患者組成的擴展隊列中進行實時定量PCR驗證，發現與癲癇發作間期相比，癲癇發作期患者血清中miR-30a、miR-378、miR-106b和miR-15a表達上調。其中，miR-30a的表達上調水平與發作頻率呈正相關，而與癲癇發病的性別、年齡、病史長短無顯著相關性[27]。因此，血清miR-30a可有助于預測癲癇發作的預后。

4 小結及展望

到目前為止，對癲癇診斷的輔助檢查主要是基于腦電圖和影像學檢查，然而這些輔助檢查的陽性率不高，且費用較昂貴。因此，需要尋找經濟實惠、簡便易行的新型診斷生物標志物。近年來，通過對循環miRNA表達譜的研究，在癲癇患者和癲癇動物模型中已確定存在100多種不同miRNAs的表達變化，并有證據表明癲癇與循環miRNAs表達變化有關。然而，由于游離的循環miRNA生成具有高度異質性，且miRNA的循環環境中存在RNA酶、pH變化等因素，這在很大程度上限制了其作為生物標志物的潛力。如果miRNA被包裝在外泌體中，外泌體的膜結構可以有效保護封閉的miRNA免受生物體液中存在的RNA酶的影響，從而使外泌體中的miRNA比游離的循環miRNA更可靠。與此同時，外泌體中miRNA還可直接反映來源細胞的生理、病理及其功能狀態[28]，更有助于癲癇的精準診斷和治療。通過對外泌體中差異性表達的miRNA及其靶基因和相關調控通路的研究，可更好地對癲癇進行診治。