高效液相色譜-串聯質譜法測定飼料中喹乙醇的不確定度評估

楊彥寧，歐海軍，譚美英，隆雪明，周燦，陳福華

（湖南省獸藥飼料監察所，長沙410000）

隨著“造肉1號“味霸”“速肥肽”等非法飼料添加劑的曝光，“喹乙醇”逐步進入公眾視野。這種被稱為“新型瘦肉精”的藥物，是1965年由德國人合成的一種抗菌助生長劑[1]，具有蛋白同化作用，可提高飼料轉化率與瘦肉率，促進動物生長。但大劑量的使用喹乙醇會對動物產生毒性作用[2]。喹乙醇在體內具有一定蓄積性，可對動物或人產生致畸、致癌、致突變[3]。歐洲和美國已經禁止喹乙醇作為飼料添加劑使用。我國農業農村部第2638號公告也明確表示，由于喹乙醇獸藥的原料藥及各種制劑可能對動物產品質量安全、公共衛生安全和生態安全存在風險隱患，根據《獸藥管理條例》第六十九條規定，決定停止在食品動物中使用喹乙醇。因此，喹乙醇檢測結果的準確性在保障動物源性食品安全和公共衛生安全，確保養殖環節依法、科學、合理用藥，為獸藥執法監管工作的有效開展提供有力的支撐時顯得尤為重要。

本文采用高效液相色譜-串聯質譜測定飼料中喹乙醇，采用JJF-1059-2012《測量不確定度評定與表示》、JJF1135-2005《化學分析測量不確定評定》、CNAS-GL006-2019《化學分析中不確定度評估指南》等對結果進行不確定度評估，對不確定度各分量進行計算，探究影響檢測結果不確定度的影響因素，為評定檢測結果的準確性提供參考[4-9]。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜-串聯質譜（AB 3200Q Trap）：配有電噴霧離子源（ESI），固相萃取裝置，喹乙醇標準品（Dr），HLB固相萃取小柱（200 mg/6 mL），甲醇、乙腈、甲酸（色譜純）。

1.2 檢測方法

依據農業部2086號公告-5-2014《飼料中卡巴氧、乙酰甲喹、喹烯酮和喹乙醇的測定液相色譜-串聯質譜法》進行檢測。

1.3 樣品制備

準確稱量預混合飼料1 g（精確至0.01 g），加入0.1%甲酸-乙腈溶液10 mL，渦旋1 min，40℃超聲波清洗儀中超聲10 min，9 000 r·min-1離心15 min，收集上清液。殘渣用0.1%甲酸-乙腈溶液10 mL重復提取1次，合并提取液，混勻，準確量取5.0 mL總提取液于10 mL試管中，60℃氮氣吹至約2 mL，加入0.1 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液，充分溶解殘余物，為備用液。轉移至已活化的HLB固相萃取柱，待試樣完全通過固相萃取柱后用0.02 mol·L-1鹽酸3 mL和5%甲醇3 mL淋洗，擠干，用5 mL甲醇洗脫，收集洗脫液并氮氣吹干，用20%乙腈溶液1 mL充分溶解，過0.22μm濾膜后上高效液相色譜-串聯質譜儀（LC-MS/MS）檢測。

1.4 儀器條件

1.4.1色譜條件

色譜柱ACQUITY UPLC BEH C18柱（2.1 mm×100 mm 1.7μm），柱溫為40℃；進樣體積10μL流速為0.5 mL·min-1，流動相A乙腈，流動相B為0.1%甲酸水溶液，梯度為0～0.5 min，體積分數為5%的B溶液；0.5～4 min，體積分數為5%～90%的B溶液，4～6 min，體積分數為90%的B溶液，6～7 min，體積分數為90%～5%的B溶液。

1.4.2質譜條件

離子化模式為電噴霧正離子模式，質譜掃描方式為MRM，離子源溫度為600℃、碰撞能量及定性定量離子質譜參數如表1所示。

表1喹乙醇質譜參數及保留時間

2 結果與討論

2.1 數學模型

采用外標法定量，按下式計算喹乙醇含量：

式中，X為樣品中待測組分含量（mg·kg-1）；C被測樣品濃度（μg·mL-1）；V1提取液定容體積；V2用于SPE凈化的提取液體積，5 mL；V3最終上機的濃縮液體積，1 mL；m樣品質量（g）。上述公式依據樣品測定原理給出，未考慮隨機因素對測量結果的影響。

2.2 不確定度來源

根據檢測過程和喹乙醇含量的計算公式，得到不確定度來源圖，見圖1。

2.3 各分量標準不確定度的評估

2.3.1測量重復性的相對標準不確定度

由于分析過程中，很多操作引入的不確定度具有一定的重復性，如天平稱量，移液管轉移液體，容量瓶定容體積，回收率等操作等，因此，可以將此類分量進行歸納，引入重復性，即精密度，用于分析研究過程中隨機變化引入的不確定度。精密度主要采用統計學方式進行研究，對加標樣品中喹乙醇含量進行一系列平行測試，得到分析過程總隨機變化，以該標準化差值的標準偏差評估試驗過程的重復性不確定度。

在重復性條件下，對同一加標樣品中喹乙醇的含量進行獨立8次測量，結果見表2，綜合上述數據，按照貝塞爾公式計算測量結果的標準差，單次測量的標準不確定度為：

其算數平均值的標準不確定度為：

重復條件下，喹乙醇含量的相對標準不確定度為：

上述分量合并研究各種隨機因素，如體積讀數偏差、LC-MS/MS變動，樣品混合不均勻以及HLB固相萃取小柱對回收率的影響等，后續評定其他分量時，不再考慮各種隨機因素。

2.3.2試樣稱量引入的不確定度

試樣稱量引入的不確定度主要是天平的校準，允許誤差±0.001 g，假定為均勻分布，其標準不確定度為：

預混合飼料1 g，則其相對標準不確定度為：

2.3.3提取液V1引入的不確定度

用10 mL單標吸管吸取10 mL 0.1%甲酸-乙腈提取液，根據檢定規程JJG196-2006[8]，10 mL A級吸管允許誤差為±0.02 mL，假定為三角分布，則10 mL的單標吸管的相對標準不確定度為：

由于方法中，需重復提取1次，兩次移取獨立不相關，因此，提取液引入的不確定度合成得：

圖1喹乙醇檢測過程中不確定度來源

表2加標飼料中喹乙醇含量mg kg-1

2.3.4凈化液V2引入的不確定度

從提取液中量取5.0 mL待氮吹、凈化，根據檢定規程JJG196-2006，5 mL A級單標吸管允許誤差為±0.015 mL，假定為三角分布，則5 mL單標吸管的相對標準不確定度為：

2.3.5用于測定樣品定容體積V3引入的不確定度

用1 mL的單標吸管量取20%乙腈溶液充分溶解已吹干試樣，根據檢定規程JJG196-2006，1 mL A級單標吸管的允許誤差為±0.007 mL，假定為三角分布，1 mL的單標吸管的相對標準不確定度為：

2.3.6標準品引入的不確定度

標準品純度引入的不確定度：方法中采用的喹乙醇標準品，純度為97.89%，根據證書提供的不確定度為0.73%，假定均勻分布，則其不確定度為：

標準品稱量引入的不確定度：準確稱量標準品喹乙醇8.523 85 g，稱量時使用分辨率0.000 01 g分析天平，由2.3.2可知，其相對標準不確定度為：

標準儲備液定容引入的不確定度：標準品用甲醇定容至10 mL，使用容量瓶為10 mL A級，根據檢定規程JJG196-2006，10 mL A級容量瓶的允許誤差為±0.02 mL，假定為三角分布，則10 mL的容量瓶的標準不確定度為：

綜上，在標準液配制時引入的不確定度由上述三種合成，即

使用標準溶液因溫度變動引起的標準溶液濃度不確定度：室溫（20±5℃），甲醇的膨脹系數為1.1×10-3/℃，則由溫度引起的體積變化為±5×1.1×10-3=±0.005 05 mL，假定均勻分布，則：u（T）=標準品引入的不確定度由以上不確定度合成，由標準溶液引入的不確定度為：

2.3.7測定液引入的不確定度

本次人工配制濃度為0.834 4 mg·mL-1喹乙醇儲備液，稀釋為62.58、104.3、208.6、417.2、834.4 ng·mL-1標準系列，引入不確定度，校正曲線為Ai=a+bCi，由工作曲線變動性引起濃度c的標準不確定度分量為：校正曲線各個參數如表3所示。

表3校正曲線參數

2.4 合成標準不確定度

2.4.1相對不確定度

各分量的相對標準不確定度見表4。

表4相對不確定度各分量

按照評定不確定度的測量模型計算喹乙醇含量的合成不確定度，

本次測定，樣品中喹乙醇為0.763 mg·kg-1，則

2.4.2擴展不確定度

根據國際慣例95%置信概率取包含因子K=2，則擴展不確定度為u（x）=k×u=2×0.012 2=0.024 4 mg·kg-1。

2.5 檢測結果的表示

用液相色譜-串聯質譜測定飼料中喹乙醇，結果表示為（0.763±0.0244）mg·kg-1，其中擴展系數為k=2。

3 結果分析

由相對不確定度直方圖（見圖2）可以看出，對喹乙醇結果影響最大的是urel（V1），即提取液的體積，其次是重復性操作urel（fr）及標準溶液的配制urel（s），因此，在對飼料中喹乙醇含量進行檢測時，應盡量確保提取液體積移取準確，標準溶液配制及稀釋精準，在條件允許情況下，多作平行樣，保證重復性操作的規范性，消除系統誤差影響。

圖2相對不確定度直方圖

4 結論

通過分析高效液相色譜-串聯質譜測定飼料中喹乙醇不確定度來源，對各不確定度分量進行計算，得出當飼料中喹乙醇含量為0.763 mg·kg-1時，其擴展不確定度為0.0244 mg·kg-1（k=2）。通過對其中不確定分量進行分析發現，影響檢測結果的主要因素是提取液體積、重復性操作、以及標準品的配制與稀釋，因此，在實際檢測中，應嚴格控制試驗條件，保證移液管等規范使用，標準溶液配制準確無誤，也應加強檢驗人員崗位培訓，確保試驗過程規范性和重現性，減小此類不確定度分量對檢測結果帶來的影響，也為飼料質量安全控制提供有效、可靠、可溯源的測量數據。