鴉膽子不同極性部位抑制ras突變的腫瘤活性譜效關系研究△

任偉鈺，馬天翔，包靖靖，鄭宜鋆，王亞麗，3，劉東玲，3*，顧志榮*

1.甘肅中醫藥大學 藥學院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省人民醫院 藥劑科，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅省中藥質量與標準研究重點實驗室，甘肅 蘭州 730000

鴉膽子為苦木科鴉膽子屬植物Bruceajavanica(L.)Merr.的干燥成熟果實，又名老鴉膽、苦參子、小苦楝等，味苦，性寒，有小毒，具有清熱解毒、燥濕殺蟲、止痢截瘧的功效。目前從鴉膽子中分離鑒定了苦木內酯及其苷類、類苦木素類、生物堿類、黃酮苷類等成分，這些成分具有抗炎、抗菌、抗瘧、抗腫瘤等廣泛的藥理作用[1]。研究發現，鴉膽子苦醇對黑色素瘤B-16、白血病L-1210及P-388等細胞有明顯的抑制效果，鴉膽子苦苷A、B和鴉膽子素E、F均具有明顯的抗腹水腫瘤及Walker氏癌肉瘤256瘤株的活性，鴉膽因D還具有抗炎、抗瘧的作用[2]。研究發現，大約30%的人類腫瘤存在ras基因突變，且多種腫瘤均檢測到p21ras過表達，表明ras基因突變和p21ras過表達確與惡性腫瘤發生有關[3]。因此，開發能抑制人類腫瘤中ras基因突變的藥物是眾多研究人員廣泛關注的問題。

有研究表明，苦木內酯類化合物鴉膽苦醇、鴉膽因D、鴉膽因A、鴉膽丁醇有抗腫瘤作用[4]，但鴉膽子化學成分種類較多，活性成分極為豐富，因此按不同極性或提取部位進行研究，對于全面深入闡釋鴉膽子抗腫瘤活性及其物質基礎具有積極意義。因此，本實驗參照文獻方法，采用不同有機溶劑提取鴉膽子，得到不同極性部位，探究不同部位提取物抑制ras突變腫瘤活性的譜效關系，為闡釋其抗腫瘤作用及物質基礎提供參考[1，5]。

1 材料

1.1 線蟲、菌株

1.2 試藥

鴉膽子購于蘭州市黃河藥材市場，經甘肅中醫藥大學藥學院晉玲教授鑒定為苦木科鴉膽子B.jauanica(L.) Merr.的干燥成熟果實；對照品鴉膽子苦醇(批號：112586，純度：97%，上海同田生物技術股份有限公司)；二甲基亞砜(DMSO，上海中秦化學試劑有限公司)；石油醚(30～60 ℃)、三氯甲烷、乙酸乙酯、無水乙醇，均為分析純(天津市百世化工有限公司)；甲醇為色譜純(天津市康科德科技有限公司)；水為二次蒸餾水；LB液體培養基、LB固體培養基、NGM培養基、M9緩沖液、裂解液、S緩沖液、檸檬酸緩沖液均為實驗室配制。

1.3 儀器

Agilent 1260型Infinity液相色譜儀(美國安捷倫公司)；DL-180型超聲波清洗器(浙江象山縣石蒲海天電子儀器廠)；AF10O4N型萬分之一電子天平(上海精密科學儀器有限公司)；GFL3033型氣浴恒溫搖床(北京博勵行儀器公司)；B2型生物安全柜(美國Thermo Fisher公司)；倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；THZ-82型搖床(金壇市恒豐儀器廠)；GR60DR型滅菌鍋(廈門儀器廠)；浮游生物計數板(北京普利特儀器有限公司)；SQP型電子天平(北京賽多利斯科學儀器有限公司)。

2 方法與結果

2.1 鴉膽子不同極性部位提取

2.1.1預處理 鴉膽子置于干燥箱中，于80 ℃恒溫干燥2 h至恒定質量，待其冷卻，用粉碎機粉碎，得鴉膽子粉(過100目篩)。精密稱取藥粉500 g，按藥粉-石油醚1∶6浸泡2次，每次24 h，合并濾液，濾渣80 ℃烘干，冷卻，得脫脂鴉膽子粉，冷藏備用。

2.1.2不同極性部位提取 將脫脂鴉膽子粉加入至95%乙醇中，鴉膽子粉與乙醇為7∶1，60 ℃回流提取2次，每次2 h，得到苦味浸膏，依次用三氯甲烷及乙酸乙酯萃取，回收溶劑，干燥。分別得到三氯甲烷部位、乙酸乙酯部位以及殘余部位，備用。

2.2 鴉膽子不同部位HPLC特征圖譜建立

2.2.1色譜條件 安捷倫z0RBAx ODS色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相甲醇(A)-水(B)梯度洗脫(0～7 min，20%～60%A；7～18 min，60%～80%A；18～22 min，80%～20%A)，柱溫25 ℃，檢測波長277 nm，體積流量1.0 mL·min-1，進樣量20 μL[6]。

2.2.2供試品溶液制備 精密稱取三氯甲烷部位、乙酸乙酯部位、殘余部位粉末0.051 1、0.050 2、0.051 4 g，分別置于25 mL量瓶中，加入甲醇，超聲輔助使完全溶解，定容至刻度，搖勻，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液進樣。

2.2.3方法學考察 按照《中華人民共和國藥典》2015年版[7]方法考察穩定性、重復性、精密度、加樣回收率，RSD均小于3.0%，符合要求。

2.2.4不同萃取部位HPLC特征圖譜建立 按照2.2.1項下色譜條件，建立不同部位HPLC特征圖譜，見圖1。特征峰峰面積見表1?？芍?，不同部位的共有色譜峰有17個，其中三氯甲烷部位有12個，乙酸乙酯部位及殘余部位各有13個。經對照品比對，確認14號峰為鴉膽子苦醇。對比不同極性部位色譜圖，發現各部分化學成分及含量存在較大差異。

新興的近代慈善事業實際上是近代城市慈善事業，是“以近代城市的興起為依托、為載體的”[1]55。慈善義演作為近代慈善事業的重要活動形式之一，與近代都市文化的發展具有密不可分的聯系，它產生于都市，并發展于社會近代化和城市化過程之中，而并非鄉村地區，這是慈善義演作為近代慈善事業的表現形式的重要標志。從慈善義演的形式看，它是通過藝人演出的方式籌集資金來進行慈善救助的行為，而這種演出的形式，則是多種多樣，但是從根本上說，藝術演出這種行為本身，便是要滿足具有近代意義的都市社會的娛樂需要。首先，作為一種常規的籌募方式，一種普遍存在的慈善救助形式，它的發起要具備三個基本條件：

表1 不同部位HPLC特征峰峰面積

注：1～17表示特征峰；A.三氯甲烷部位；B.乙酸乙酯部位；C.殘余部位。圖1 三氯甲烷部位、乙酸乙酯部位和殘余部位色譜圖

2.3 鴉膽子不同部位對秀麗隱桿線蟲的急性毒性實驗

2.3.1培養基及溶液配制 LB液體培養基：1 L培養基中加入蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化鈉10 g，并用1 mol·L-1的NaOH溶液調pH至7.0，121 ℃溫度下滅菌20 min；LB固體培養基：LB液體培養基高壓滅菌前加入細菌瓊脂粉15 g·L-1，121 ℃，滅菌15 min；NGM培養基：1 L培養基中加入NaCl 3 g、蛋白胨2.5 g、瓊脂17 g、1 mol·L-1K2HPO4-KH2PO4緩沖液(pH=6.0) 25 mL、蒸餾水975 mL，滅菌后加入濾過除菌的5 mg·mL-1膽固醇溶液、1 mol·L-1MgSO4溶液、1 mol·L-1CaCl2溶液各1 mL；M9緩沖液：1 L緩沖液中含Na2HPO4·12H2O 15 g、KH2PO43 g、NaCl 5 g、Mg2SO4·7H2O 0.25 g；裂解液：6.4% NaClO溶液和1 mol·L-1NaOH溶液按1∶1混合；S緩沖液：1 L蒸餾水中加入NaCl 5.85 g、K2HPO41 g、KH2PO46 g，混勻，滅菌，制成S基礎液，1 L S基礎液加入檸檬酸緩沖液10 mL、Trace液10 mL、5 mg·mL-1膽固醇1 mL、1 mol·L-1MgSO43 mL、1 mol·L-1CaCl2溶液3 mL，混勻；檸檬酸緩沖液：檸檬酸20 g、檸檬酸鉀293.5 g、蒸餾水1000 mL，混合均勻。

2.3.2大腸桿菌OP50培養 從-80 ℃冰箱中取出凍存的大腸桿菌OP50菌液，于LB固體培養基上用接種環劃線，37 ℃培養過夜，取單克隆菌落接種到LB液體培養基中，置于搖床上，37 ℃，培養10～12 h，備用，可根據要求稀釋處理。

2.3.3線蟲培養 在已制備好的NGM培養皿上用涂棒每板涂400 μL的大腸桿菌OP50菌液，37 ℃培養過夜，冷卻后將凍存在-80 ℃冰箱內的秀麗隱桿線蟲MT2124取出，迅速解凍，鋪于培養基上，在21 ℃培養箱中培養至成蟲。

2.3.4線蟲同步化 將在培養皿中培養了5～6 d的線蟲用M9緩沖液沖洗到5 mL離心管中，靜置，棄去上清后，剩下液體少許，加入裂解液，在渦旋儀上震蕩約7 min，使線蟲充分裂解，3000 r·min-1(離心半徑9 cm)，離心3 min后，棄去上清液，用M9緩沖液沖洗2次，棄去沖洗液，得到線蟲蟲卵。加M9緩沖液至1 mL，在培養箱中放置48 h后，線蟲發育達到Ll期。收集Ll期幼蟲備用。

2.3.5藥液制備 精密稱定三氯甲烷部位、乙酸乙酯部位及殘余部位粉末各0.5 g，用DMSO配制成質量濃度為250 mg·mL-1的藥液，超聲輔助溶解，精密吸取200 μL，以蒸餾水稀釋并超聲，得到質量濃度為25 mg·mL-1的混懸狀母液，然后按一定濃度梯度稀釋備用。

2.3.6分組與給藥 在96孔板上精密加入M9緩沖液80 μL、線蟲液20 μL及按一定濃度梯度稀釋的藥液100 μL，使其終質量濃度為0、0.156 25、0.312 5、0.625 0、1.250 0、2.500 0 mg·mL-1，混合均勻，并設置相應空白對照和陰性對照組，空白對照組為不加藥液線蟲組，陰性對照組為溶媒對照組(包含M9緩沖液80 μL、線蟲液20 μL及DMSO 100 μL)，以檢測DMSO是否對線蟲有影響。

2.3.7鴉膽子不同部位急性毒性測定 加藥后24 h，顯微鏡下觀察線蟲死亡情況，采用浮游生物計數板計數，并根據公式(1)計算線蟲死亡率。

死亡率=加藥后線蟲數量/加藥前線蟲數量×100%

(1)

各萃取部位對線蟲的半數致死量(LC50)結果見圖2。三氯甲烷部位毒性較大，標準曲線方程為Y=10.195 04+20.304 74X，擬合度R2為0.951 73，r為 0.975 6，經計算其LC50為1.96 mg·mL-1；乙酸乙酯部位與殘余部位毒性在一定范圍內隨質量濃度增大而增大，但并未達到半數致死，故各部位的急性毒性大小為三氯甲烷部位>乙酸乙酯部位>殘余部位。

圖2 鴉膽子不同萃取部位對秀麗隱桿線蟲的急性毒性

2.4 鴉膽子各部位抗腫瘤作用

2.4.1大腸桿菌及線蟲的培養 按照2.3.1項下條件培養大腸桿菌OP50，按照2.3.2項下條件大量培養線蟲。

2.4.2藥液制備 將2.3.4項下制備的質量濃度為25 mg·mL-1的藥液經0.45 μm微孔濾膜濾過，按一定濃度梯度稀釋備用。

2.4.3分組與給藥 根據預試驗結果，在96孔板上加入S基礎液140 μL、線蟲液20 μL、大腸桿菌OP50菌液20 μL及一定濃度梯度的藥液20 μL，最終三氯甲烷部位的質量濃度為2、10、50 μg·mL-1，乙酸乙酯部位的質量濃度為20、100、500 μg·mL-1，殘余部位質量濃度為20、100、500 μg·mL-1，混合均勻，并設置相應空白對照和陰性對照。

2.4.4不同部位抗腫瘤作用 以野生型秀麗隱桿線蟲為藥物抗腫瘤作用評價指標，考察不同濃度、不同部位藥液抗腫瘤作用，按照公式(2)計算野生型線蟲占比。野生型線蟲占比越高，則提取物抗腫瘤效果越好。

野生型線蟲占比=野生型線蟲數/線蟲總數×100%

(2)

結果見圖3。與對照組比較，隨著鴉膽子三氯甲烷部位質量濃度增大，野生型線蟲占比顯著增大(P<0.01)；乙酸乙酯萃取部位在100～500 μg·mL-1時呈一定抗腫瘤活性；殘余部位在500 μg·mL-1時有一定抗腫瘤活性。因此，各部位中，三氯甲烷萃取部位抑制ras突變的抗腫瘤活性最強，乙酸乙取部位次之，殘余部位基本無藥效。

圖3 鴉膽子各萃取部位抗腫瘤活性

2.5 譜效關系研究

三氯甲烷萃取部位抗腫瘤活性最強，其所有色譜峰所對應化學成分均有進一步研究的價值。為了明確其他萃取部位色譜峰與抗腫瘤作用之間的相關性，對乙酸乙酯部位與殘余部位色譜峰進行偏最小二乘回歸(PLS)法分析，并與三氯甲烷部位相結合探討鴉膽子提取物抑制ras突變腫瘤活性的譜效關系。

以乙酸乙酯部位與殘余部位HPLC特征圖譜各峰面積作為自變量，野生型線蟲占比作為因變量，將峰面積歸一化數據導入SIMCA-P 13.0軟件中進行分析，計算得到16個色譜峰與野生型蟲體比例的標準化回歸系數和變量重要性投影(VIP)值(見圖4～5)。當VIP>1時，說明所對應化合物對抑制ras突變的腫瘤活性有重要作用。由圖5可知，峰7、8、10～12的VIP均大于1。

圖4 乙酸乙酯部位與殘余部位各色譜峰PLS標準化回歸系數

圖5 乙酸乙酯部位與殘余部位各色譜峰對藥效的VIP貢獻

3 討論

人類生長因子受體介導的Ras/絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路是與細胞增殖、分化、凋亡等密切相關的重要信號通路，該信號通路發生異常與腫瘤的發生、發展密切相關[8]。秀麗隱桿線蟲let-60編碼的ras蛋白與人類的ras蛋白在前面164個氨基酸中相似度高達83%[9]。秀麗隱桿線蟲中的Ras/MAPK信號通路是高度保守的，若let-60過度激活會使線蟲陰門數量增多，形成多陰門表型(Muv)線蟲，相反則會產生無陰門的線蟲汀[10]。秀麗隱桿線蟲可作為篩選靶向Ras/MAPK信號通路的藥物候選物的模型。本研究采用該模型篩選鴉膽子中抑制ras突變腫瘤活性的萃取部位以及不同提取物的毒性，野生型蟲體比例越高，則說明藥物抑制ras基因突變作用越強，藥效越好。

鴉膽子中的多種化學成分對多種腫瘤具有廣泛的抗癌作用。如鴉膽子油乳有明顯的抑制腫瘤作用，目前已被應用于臨床[11]，可用于肺癌、直腸癌、骨轉移癌、宮頸癌等的治療[12-14]。然而，在提取鴉膽子油過程中，鴉膽子脫脂后產生的藥渣卻作為畜禽飼料添加劑，導致大量活性成分被浪費[15]。本研究對鴉膽子脫脂后的不同萃取部位進行抗腫瘤活性研究，發現三氯甲烷部位抗腫瘤活性最強，其中14號峰(鴉膽子苦醇)為三氯甲烷部位的特有成分?，F代研究發現，鴉膽子苦醇可通過誘發腫瘤細胞的內質網應激(ERS)及抑制人乳腺癌MCF-7細胞的核因子E2相關因子2(Nrf2)來誘導癌細胞凋亡[16]；也可抑制人惡性黑色素瘤A375細胞Nrf2信號通路，激活線粒體凋亡途徑相關蛋白，加速癌細胞凋亡，從而抑制癌細胞增殖[17]；還可通過調節細胞內轉移相關蛋白的表達而對非小細胞肺癌的轉移能力有明顯的抑制作用[18]。

本研究結合數學模型與計算機技術分析了鴉膽子三氯甲烷部位、乙酸乙酯部位、殘余部位的HPLC圖譜與藥效學指標之間的內在相關性，能夠為篩選鴉膽子不同提取部位抑制ras突變腫瘤的活性成分提供有益參考。其中三氯甲烷萃取部位抗腫瘤活性最強，其所有色譜峰所對應化學成分均有進一步研究的價值。此外，除14號峰(鴉膽子苦醇)外，峰7、8、10～12所對應的化合物對抑制ras突變的腫瘤活性也具有重要作用，目前本研究組正在基于LC-MS技術對這些化合物進行定性定量分析。