基于彗星實驗的大黃素型單蒽酮體內外毒性研究△

文海若，顏玉靜，王曼虹，趙婷婷，楊瑩，馬雙成，汪祺

1.中國食品藥品檢定研究院 國家藥物安全評價監測中心/藥物非臨床安全評價研究北京市重點實驗室，北京 100176；2.中國食品藥品檢定研究院 中藥民族藥檢定所，北京 100050

蓼科植物何首烏與人參、靈芝和冬蟲夏草并稱“四大仙草”。作為臨床常用補益良藥，何首烏被廣泛用于藥品和保健品中，《中華人民共和國藥典》2015年版中已收錄近50個何首烏成方制劑[1]。近年來何首烏相關的臨床毒副作用報道屢見不鮮，何首烏引起的藥源性肝損傷(drug-induced liver injury，DILI)病例數在全部中藥肝損傷中居首位[2]，其毒性作用研究在學界受到重視。何首烏的主要化學成分包括二苯乙烯苷類、蒽醌類、蒽酮類及磷脂類等。有學者提出“蒽醌致毒”的觀點[3-4]，并指出游離蒽醌(大黃素、大黃酚、大黃酸等)是何首烏的主要毒性成分，其作用機制包括誘導細胞凋亡、影響肝臟代謝酶功能、干擾膽汁酸分泌等。而蒽酮類在何首烏藥材中總體含量較高，但相關毒理學研究報道較少。雖單一蒽酮類成分在何首烏中含量不高，但多種二蒽酮可經不同生化通路轉化為大黃素型單蒽酮(monanthrone with emodin type)。本課題組前期研究結果顯示二蒽酮及蒽酮糖苷類成分可誘導肝毒性，且其作用機制與抑制膽紅素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉移酶1A1(UGT1A1)活性并使膽紅素代謝障礙有關[5]。因該類物質均具有相同母核，多種蒽酮類化合物均可經不同體內代謝通路轉化為單蒽酮，故有必要就其毒性作用風險進行評估[6]。

彗星電泳，又稱單細胞凝膠電泳(single cell gel electrophoresis，SCGE)，是在單細胞水平上評價受試物導致DNA鏈損傷風險的經典毒性評價方法[7]。人源肝細胞HepaRG具有類似肝臟祖細胞的分化能力，可以分化為肝細胞和膽管細胞。因其表達豐富的Ⅰ相代謝酶(如CYP1A2、2B6、2C9、2E1、3A4)、Ⅱ相代謝酶(如尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶)及多藥耐藥相關蛋白(MRP)和有機陰離子轉運多肽(OATP)等功能蛋白，適用于藥代動力學研究和毒性代謝產物的篩選[8]。本研究分別使用HepaRG構建的2D、3D肝細胞培養模型和大鼠體內重復給藥體系開展彗星實驗，評價單蒽酮的毒性風險，探討不同模型對單蒽酮毒性評價結果的影響。

1 材料

1.1 儀器與耗材

GravityPlusTM型和GravityTRAPTM型懸滴板(Insphero公司)；5180R型臺式冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；NTS-1300型恒溫振蕩水槽(東京理化器械株式會社)；DYCP-31F型和DYY-6C型電泳儀電源(北京市六一儀器廠)；Nikon eclipse 80i型熒光顯微鏡(日本Nikon公司)；Komet 6.0圖像分析系統(英國安道爾科技有限公司)。

1.2 試藥

大黃素型單蒽酮(結構見圖1，純度≥95%，中國醫學科學院藥物研究所)；甲磺酸乙酯(EMS)、絲裂霉素C(MMC)、二甲基亞砜(DMSO)、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)，Sigma-Aldrich公司；Trevigen Comet Assay?Kit彗星檢測試劑盒(Trevigen公司)；Hank′s平衡鹽溶液(HBSS)、磷酸鹽緩沖液(PBS)，Cellgro公司；RPMI 1640培養基(Hyclone公司)；1%青鏈霉素混合液(南京凱基生物科技發展有限公司)；胰蛋白酶-EDTA消化液、SYBR Green I核酸凝膠染液(Life Technologies公司)；無水甲醇、無水乙酸(北京化工廠)；胎牛血清(FBS，Gibco公司)。

圖1 大黃素型單蒽酮結構式

1.3 細胞

HepaRG細胞購自Fisher Scientific公司，本研究所用細胞為第11～12代。

1.4 動物

SPF級雄性SD大鼠30只，給藥時約5～6周齡，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXX(京)2016-0006。大鼠飼養于屏障系統的大鼠籠具內，飼養密度為2～3只/籠。換氣給予鈷60放射滅菌的鼠全價顆粒飼料喂養，自由攝食及飲水。大鼠飼養于恒溫(20～26℃)、恒濕(40%～70%)的條件下，明暗周期為12 h，每小時最低換氣次數15次。研究方案通過國家藥物安全評價監測中心實驗動物福利倫理委員會(IACUC)的倫理審查。

2 方法

2.1 基于2D細胞培養的彗星實驗

調整HepaRG細胞密度為5×105個/mL，取6孔細胞培養板，每孔添加2 mL培養液/細胞混合液，置37 ℃、5% CO2孵箱培養18～24 h。細胞達對數生長期時，更換含0.5%DMSO(對照組)、EMS 2 μg·mL-1(陽性對照組)及不同質量濃度的單蒽酮(0.01、0.10、1.00、10.00 μg·mL-1)培養液處理24 h。每組平行3孔。所用質量濃度根據課題組前期細胞毒性數據設置[半數抑制濃度(IC50)為1 μg·mL-1][9]。收獲細胞后調整細胞密度為2×105個/mL。樣本經制片、裂解、解旋、電泳、中和、脫水等步驟后制備成單細胞凝膠標本[10]。

2.2 基于3D細胞培養的彗星實驗

3D懸滴培養模型的制備方法參考王培昌等[7]使用的方法。模型在接種后的第4天將肝微組織轉移到Gravity TRAPTM板培養7 d，給予不同質量濃度的單蒽酮(0.1、1.0、10.0 μg·mL-1)，所用質量濃度根據前期細胞毒性數據設置(IC50為1～10 μg·mL-1)[9]。同時設對照組(0.5% DMSO)和陽性對照組(EMS 6 μg·mL-1)。每組平行使用3個微組織。連續給藥3次，每次48 h。細胞收獲及后續步驟同2.1項下。

2.3 大鼠體內重復給藥彗星實驗

2.3.1分組與給藥 25只雄性大鼠分設對照組(0.5% CMC-Na)、陽性對照組(EMS 200 mg·kg-1)及單蒽酮6.5、65.0、650.0 mg·kg-1組，每組5只。最大給藥劑量根據單蒽酮于0.5% CMC-Na最大可重懸濃度和預試驗結果確定。對照組和單蒽酮各劑量組大鼠連續14 d口灌胃給藥，給藥體積為15 mL·kg-1。EMS組連續3 d灌胃給藥。

2.3.2觀察與體質量檢測 給藥期間每天上午和下午隔籠觀察動物是否存在死亡、瀕死，活動狀況，外觀及被毛，有無外傷及糞便等情況；每周測定體質量2次。解剖前禁食過夜。末次給藥3 h后所有動物以CO2吸入法麻醉。

2.3.3堿性彗星實驗 大鼠麻醉后由腹腔后大靜脈取血(50 μL/只)用于彗星實驗。肝組織樣本采集肝左葉約2～3 mm3大小組織置于3 mL切碎液(含20 mmol·L-1EDTA-2Na和10% DMSO的HBSS溶液)中并使用剪刀剪碎組織以釋放細胞，經40 μm濾膜濾過后置冰上備用。后續步驟同2.1項下。

2.3.4標本檢測 所有標本使用SYBR Green I(1∶10 000)染色，并在總放大倍數為200～400倍的熒光顯微鏡下拍照。使用Komet 6.0彗星圖像分析軟件進行分析，每個標本至少分析150個彗星細胞的尾DNA含量和Olive尾距(OTM)，并計算中位數。

2.4 數據處理與統計

3 結果

3.1 2D模型彗星實驗

結果表明，單蒽酮各質量濃度組細胞尾DNA含量及OTM與對照組比較差異無統計學意義(見圖2)，即對HepaRG細胞DNA無明顯損傷作用。其中單蒽酮10.00 μg·mL-1組觀察到較多刺猬細胞，發生率為(75±4)%，當刺猬細胞發生率超過50%時，大量凋亡細胞可對彗星觀察指標產生影響，故單蒽酮10 μg·mL-1組細胞尾DNA含量和OTM數值反呈下降趨勢。

3.2 3D模型彗星實驗

課題組前期已驗證3D肝微組織中的白蛋白分泌水平和肝藥酶活性可維持至培養后10 d，實現更長期的給藥[11]。不同質量濃度單蒽酮與HepaRG細胞構建的3D微組織共同作用144 h后，結果表明，當單蒽酮質量濃度為10.0 μg·mL-1時尾DNA含量及OTM[分別為(10.6±1.9)%和(1.0±0.2)%]與對照組[分別為(1.9±0.8)%和(1.0±0.2)%]比較差異有統計學意義(見圖3，P<0.05，P<0.01)，且存在一定劑量相關性。

注：與對照組比較，***P<0.001。圖2 單蒽酮2D肝細胞模型彗星實驗結果

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。圖3 單蒽酮3D肝組織模型彗星實驗結果

3.3 大鼠體內重復給藥彗星實驗

3.3.1癥狀與體質量變化 實驗期間各組大鼠未見異常表現，各組平均體質量隨周齡增長呈平穩增長趨勢(見圖4)。各組大鼠末次體質量均有所下降，與剖檢取材前禁食過夜有關。故SD大鼠連續14 d給予單蒽酮650.0 mg·kg-1未見明顯毒性。

注：與對照組比較，**P<0.01。圖4 單蒽酮對大鼠體質量的影響

3.3.2體內彗星實驗 結果表明，單蒽酮650.0 mg·kg-1劑量組大鼠肝細胞尾DNA含量及OTM[分別為(9.4±3.9)%和(0.9±0.5)%]均顯著高于對照組[分別為(2.2±0.5)%和(0.2±0.0)%，見圖5，P<0.01]，且各劑量組之間存在一定劑量效應趨勢。而各單蒽酮給藥組大鼠的外周血有核細胞的尾DNA含量及OTM與對照組比較則未見統計學差異。表明單蒽酮對肝臟細胞的DNA損傷程度強于外周血細胞，或與單蒽酮在肝臟中的代謝產物產生的毒性更強有關。

注：與對照組比較，**P<0.01，***P<0.001。圖5 單蒽酮SD大鼠外周血和肝細胞彗星實驗結果

4 討論

單蒽酮為本課題組首次從何首烏中分離出的單體化合物[12]，其在何首烏藥材中的含量可隨貯存時間延長而升高。此外，體內存在多條生化通路可將不同蒽酮類化合物代謝為單蒽酮[6]。以研究數據為基礎的毒性預測軟件Derek Nexus(Version 6.0.1，Lhasa Limited，UK)未檢出其包括肝毒性警示結構，其肝毒性風險研究尚不充分。本課題組在前期完成的連續14 d單蒽酮經口給藥大鼠毒性研究中發現，單蒽酮可導致大鼠肝臟匯管區炎性細胞浸潤及肝臟γ干擾素(IFN-γ)的水平顯著下降，提示其具有一定肝臟毒性作用[13]。使用HepaRG細胞制備2D和3D培養模型評價單蒽酮毒性，并發現大黃素型單蒽酮經代謝后毒性降低，并可誘導Ⅰ相代謝酶CYP3A4和CYP2B6的表達量升高和外排轉運體P糖蛋白(P-gp)和MRP2的上調，可見單蒽酮的毒性與其在體內的代謝和轉歸密切相關[9]。本研究比較了體內及體外評價模型中單蒽酮的肝毒性特點，在2D肝細胞模型未見DNA損傷作用，但可誘導3D肝細胞培養模型和大鼠肝細胞出現DNA斷裂。連續14 d給予大鼠單蒽酮650.0 mg·kg-1可對肝臟細胞產生一定損傷。值得注意的是，大鼠外周血樣本中則未見給予單蒽酮誘導的DNA斷裂，提示毒性的產生與肝細胞及組織的代謝密不可分。

單蒽酮母核蒽酮結構與蒽醌結構有一定相似性，且可在體內轉化為蒽醌類大黃素。前期研究發現，大鼠口服給予大黃素型單蒽酮后，可在大鼠血液及肝臟組織中檢出單體大黃素、蘆薈大黃素型葡萄糖醛酸結合物及大黃素型單蒽酮的氧化物。其中大黃素的肝毒性和DNA斷裂風險已有諸多報道[14-15]。故單蒽酮誘導的肝臟毒性可能主要與其代謝產物有關，抑制其代謝通路或可有效減毒，該推論有待進一步研究證實。

彗星實驗是常用的體外及體內毒性評價方法，可較為靈敏地預測受試物對細胞核和DNA堿基的損傷作用。體內彗星實驗更作為重復給藥毒性研究的一部分可對不同臟器的代謝產物毒性進行評估[16]。課題組前期已驗證了體外3D肝組織彗星實驗體系對毒性預測效果優于2D評價模型，本研究中證實3D培養組織中的研究結果與體內研究結果更具可比性，再次凸顯3D肝臟培養模型在未來肝毒性評價應用前景。

綜上所述，本研究首次通過體內和體外實驗對比驗證單蒽酮的毒性物質基礎并非原型化合物而是其代謝產物，可為何首烏質量控制和合理用藥提供參考。3D肝細胞培養模型在肝毒性預測方面獨具優勢，今后可進一步結合多種肝藥酶表達檢測及細胞因子等指標，系統地開展單蒽酮及多種蒽酮類化合物毒性作用通路研究。