毛排錢草的體外抑菌活性及穩(wěn)定性評(píng)價(jià)△

羅曉東，吳志明，李海秀，吳歡，張聲源，廖富林，肖光文*

1.嘉應(yīng)學(xué)院 廣東省山區(qū)特色農(nóng)業(yè)資源保護(hù)與精準(zhǔn)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 梅州 514015；2.嘉應(yīng)學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，廣東 梅州 514031

毛排錢草Phyllodiumelegans(Lour.) Desv.別名錢串草、疊錢草、鱗貍鱗、連里尾樹(shù)等，為豆科排錢樹(shù)屬PhyllodiumDesv.植物，分布在福建、廣東、海南、廣西及云南等省區(qū)，是我國(guó)瑤族常用的民族藥。其主跌打瘀腫、風(fēng)濕痹痛、慢性肝炎，具有消炎解毒、活血利尿、清熱下痢等功效，常用于治療風(fēng)濕痹痛、慢性肝炎、小兒疳積、乳癰、瘰疬等癥[1]。

目前，針對(duì)毛排錢草的藥理活性研究主要側(cè)重于其對(duì)肝炎的治療，而抗炎、抑菌等藥理活性研究較少。文獻(xiàn)資料顯示，排錢樹(shù)屬植物化學(xué)成分以生物堿類為主，還含有醇類、萜類、酚類、黃酮類、糖類和芳香類等化合物[2]，具有抗炎、抑菌、抗肝炎、抗腫瘤等活性[3-4]。課題組在前期的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)毛排錢草對(duì)金黃色葡萄球菌具有一定的抑菌活性，但其藥用活性部位不明確，活性物質(zhì)基礎(chǔ)不清晰。因此，本研究以毛排錢草為研究對(duì)象，考察其根、莖和葉3個(gè)不同藥用部位醇提物的抑菌活性，以篩選活性藥用部位，明確活性物質(zhì)基礎(chǔ)，進(jìn)而探討其在不同環(huán)境條件下的抑菌穩(wěn)定性，為毛排錢草的藥用價(jià)值的開(kāi)發(fā)及天然食品防腐劑的研究提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 試藥

毛排錢草于2018年9月購(gòu)自廣西省玉林市博白縣，經(jīng)嘉應(yīng)學(xué)院醫(yī)學(xué)院天然藥物教研室翟明講師鑒定為豆科排錢樹(shù)屬植物毛排錢草P.elegans(Lour.) Desv.。留樣保存于客家養(yǎng)生保健研究所客家中草藥化學(xué)實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)所用菌種包括金黃色葡萄球菌StaphylococcusaureusATCC6538、藤黃微球菌MicrococcusluteusATCC49732、大腸埃希菌EscherichiacoliATCC25922、銅綠假單胞菌PseudomonasaeruginosaATCC9027、枯草芽孢桿菌BacillussubtilisATCC6633、變形桿菌ProteusvuigarisATCC13315，均來(lái)源于廣東省菌種保藏中心，保存于嘉應(yīng)學(xué)院醫(yī)學(xué)院病原教研室。

青霉素鈉原料藥(批號(hào)：6121010150，純度≥99%)、硫酸鏈霉素原料藥(批號(hào)：73210101100，美國(guó)藥典級(jí))，美國(guó)Genview公司；95%乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、丙酮等均為分析純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；水為滅菌蒸餾水；MH瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)：190306)、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(批號(hào)：190308)均購(gòu)自江門凱林貿(mào)易生物公司。氯化鈉、氯化鉀、無(wú)水氯化鈣、三氯化鐵、氫氧化鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；無(wú)水檸檬酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

1.2 儀器

FL-30型流水式高速中藥粉碎機(jī)(瑞安市富力中藥機(jī)械廠)；N-1100V型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛(ài)朗儀器有限公司)；TG16-WS型臺(tái)式高速離心機(jī)(長(zhǎng)沙維爾康湘鷹離心機(jī)有限公司)；YXQ-LS-75SII型立式壓力蒸汽滅菌器(上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司)；BSC-1100ⅡA2-X型超凈工作臺(tái)(濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司)；PB-21型酸度計(jì)[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]；WFH-203B型三用紫外分析儀(上號(hào)精科實(shí)業(yè)有限公司)；WGZ-XT型細(xì)菌濁度儀(杭州齊威儀器有限公司)。

2 方法

2.1 毛排錢草不同藥用部位的體外抑菌活性測(cè)定

2.1.1不同藥用部位醇提物的制備 稱取毛排錢草根、莖、葉干品100 g，粉碎，分別加入95%乙醇浸泡過(guò)夜，室溫下超聲(功率：250 W，頻率：45 kHz)提取3次，每次30 min，真空抽濾，合并3次濾液，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，分別得毛排錢草根、莖、葉醇提物浸膏10.22、7.10、10.50 g。將各提取物用40%丙酮-蒸餾水溶液溶解，制備成生藥質(zhì)量濃度為1 g·mL-1的藥液(相當(dāng)于根、莖、葉藥液每毫升分別含有0.102 2、0.071 0、0.105 0 g醇提物浸膏)，密封置4 ℃冰箱保存，備用，實(shí)驗(yàn)前均用0.22 μm微孔濾膜除菌。

2.1.2對(duì)照液的制備 空白對(duì)照液：40%丙酮-蒸餾水溶液。陽(yáng)性藥對(duì)照液：將40%丙酮-蒸餾水溶液作為溶劑，分別配制質(zhì)量濃度為青霉素鈉128 μg·mL-1和硫酸鏈霉素300 μg·mL-1的藥液。

2.1.3菌懸液的制備 超凈工作臺(tái)內(nèi)，從斜面培養(yǎng)基上挑取適量菌落接種于肉湯培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)18～24 h，轉(zhuǎn)接1次。使用前用生理鹽水稀釋各實(shí)驗(yàn)菌株至0.5麥?zhǔn)蠞岫?相當(dāng)于1.5×108CFU·mL-1)，再取適量菌懸液，用生理鹽水或肉湯培養(yǎng)基稀釋至1.5×106CFU·mL-1，備用。

2.1.5最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)的測(cè)定 采用微量肉湯稀釋法測(cè)定MIC。超凈工作臺(tái)內(nèi)，取一次性無(wú)菌96孔培養(yǎng)板，第2孔至第11孔均加入100 μL肉湯培養(yǎng)基，再分別吸2.1.1項(xiàng)制備的藥液100 μL注入第1、2孔，反復(fù)吹打，充分混勻后從第2孔中吸100 μL注到第3孔，如此等倍稀釋，至第10孔吹打混勻后棄去100 μL；第11孔不加入藥液，以觀察菌是否適宜生長(zhǎng)；第12孔注入200 μL肉湯培養(yǎng)基，以此判斷培養(yǎng)基是否被污染。隨后分別向上述1～11孔中注入含1.5×106CFU·mL-1各實(shí)驗(yàn)菌的肉湯培養(yǎng)基100 μL，充分混勻后放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，取出觀察生長(zhǎng)情況，以培養(yǎng)基澄清透明或無(wú)沉淀為無(wú)菌生長(zhǎng)，將無(wú)菌生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)孔中最低生藥濃度記作MIC。

分別從無(wú)菌生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)孔中吸取培養(yǎng)基100 μL分別注到MH瓊脂培養(yǎng)基表面，涂布均勻后放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)18～24 h，取出觀察結(jié)果，用活菌計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)菌落，將平均菌落數(shù)<5的最小生藥濃度記作MBC。以上實(shí)驗(yàn)平行操作3次。

2.2 毛排錢草根不同極性提取物的體外抑菌活性測(cè)定

2.2.1不同極性部位提取物的制備 稱取1 kg毛排錢草根經(jīng)粉碎后，按照2.1.1項(xiàng)下方法制得毛排錢草根的醇提物浸膏102.26 g。取90 g浸膏超聲分散于蒸餾水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取3～5次，合并萃取液，減壓旋轉(zhuǎn)濃縮，分別得石油醚部位1.10 g、乙酸乙酯部位5.07 g、正丁醇部位18.64 g、水部位61.14 g，樣品均置于干燥西林瓶中密封保存?zhèn)溆谩⒏鳂悠酚?0%丙酮-蒸餾水溶液溶解，制備成生藥質(zhì)量濃度為1 g·mL-1的藥液(各層藥液每毫升分別含有0.001 2、0.005 7、0.021 1、0.069 3 g浸膏)，密封置4 ℃冰箱保存，備用，實(shí)驗(yàn)前均用0.22 μm微孔濾膜除菌。

2.2.2抑菌活性評(píng)價(jià) 依次吸取2.2.1項(xiàng)制備的藥液，按照2.1.4項(xiàng)下方法評(píng)價(jià)各極性部位藥液對(duì) 6種菌的抑菌活性。依次吸取2.2.1項(xiàng)制備的藥液，按照2.1.5項(xiàng)下方法分別測(cè)定各極性部位藥液對(duì)6種菌的MIC和MBC。

2.3 毛排錢草根正丁醇部位抑菌穩(wěn)定性研究

2.3.1熱穩(wěn)定性研究 參考陳佳佳等[6]實(shí)驗(yàn)方法，將生藥質(zhì)量濃度為1 g·mL-1的毛排錢草根正丁醇部位藥液于60、80、100、121 ℃條件下(其中60、80、100 ℃于水浴鍋中水浴30 min，121 ℃于高壓蒸汽鍋中濕熱處理30 min)處理后，以金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌作為指示菌，采用牛津杯法測(cè)定其抑菌活性，并以未經(jīng)處理過(guò)的藥液(40 ℃)作為對(duì)照。

2.3.2紫外線穩(wěn)定性研究 參考李晨等[7]實(shí)驗(yàn)方法略作修改，將生藥質(zhì)量濃度為1 g·mL-1的毛排錢草根正丁醇部位藥液置于紫外燈(254 nm)下照射10、20、30、60 min后，金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌分別作為指示菌，以未經(jīng)處理過(guò)的藥液(0 min)作為對(duì)照。

2.3.3酸堿穩(wěn)定性研究 參考任先偉等[8]實(shí)驗(yàn)方法略作修改，用0.1 mol·L-1NaOH和0.1 mol·L-1檸檬酸調(diào)節(jié)毛排錢草根正丁醇部位藥液的pH，分別調(diào)整pH為3、5、7、9、11，同時(shí)藥液的生藥質(zhì)量濃度為1 g·mL-1，平衡30 min，以金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌分別作為指示菌，并以未經(jīng)處理過(guò)的藥液(pH=5.9)作為對(duì)照。

2.3.4金屬離子穩(wěn)定性研究 參考張媛媛[9]實(shí)驗(yàn)方法，在毛排錢草根的正丁醇提取物中分別加入NaCl、KCl、CaCl2和FeCl3，分別配制成含0.05 mol·L-1的Na+、K+、Ca2+和Fe3+溶液，同時(shí)藥液的生藥質(zhì)量濃度為1 g·mL-1，靜置3 h，金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌分別作為指示菌，以未經(jīng)處理過(guò)的藥液作為對(duì)照。

3 結(jié)果與分析

3.1 毛排錢草不同藥用部位提取物體外抑菌活性

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，毛排錢草根、莖和葉對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌等6種菌均具有不同程度的抑菌作用，其作用強(qiáng)弱為根>葉>莖(見(jiàn)表1)。毛排錢草不同藥用部位對(duì)6種菌的MIC、MBC結(jié)果與抑菌圈測(cè)定結(jié)果吻合(見(jiàn)表2)。其中毛排錢草根的抑菌活性較強(qiáng)，對(duì)6種菌均有抑菌作用(MIC、MBC在7.81～500.00 mg·mL-1)；其次是毛排錢草葉、莖，但對(duì)大腸埃希菌無(wú)明顯抑菌活性。因此，下一步將對(duì)毛排錢草根不同極性部位進(jìn)行抑菌活性評(píng)價(jià)，以明確其強(qiáng)活性部位。

表1 毛排錢草不同藥用部位的抑菌圈直徑 mm

表2 毛排錢草不同藥用部位提取物對(duì)各菌株的MIC和MBC mg·mL-1

3.2 毛排錢草根不同極性部位提取物體外抑菌活性

由表3、4可見(jiàn)，在相同生藥質(zhì)量濃度下，毛排錢草根不同極性部位對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌等革蘭陽(yáng)性菌均表現(xiàn)出不同程度的抑菌活性，對(duì)大腸埃希菌、變形桿菌等革蘭陰性菌活性較差；總體抑菌活性表現(xiàn)為正丁醇部位>水部位>乙酸乙酯部位>石油醚部位，其中正丁醇部位對(duì)各種菌的MIC、MBC在15.63～125.00 mg·mL-1，對(duì)銅綠假單胞菌亦表現(xiàn)出一定的抑菌效果。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)以正丁醇部位作為研究對(duì)象，考察其在不同條件下對(duì)敏感菌的抑菌穩(wěn)定性。

表3 毛排錢草根不同極性部位的抑菌圈直徑 mm

表4 毛排錢草根不同極性部位提取物對(duì)各菌株的MIC和MBC mg·mL-1

3.3 毛排錢草根正丁醇部位的抑菌穩(wěn)定性

3.3.1溫度對(duì)提取物抑菌穩(wěn)定性的影響 與40 ℃時(shí)比較，溫度為60 ℃時(shí)，毛排錢草根正丁醇部位對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性明顯減弱(P<0.05)，但仍然保持敏感；隨著溫度的升高，抑菌活性持續(xù)減弱。對(duì)于銅綠假單胞菌，溫度為60～121 ℃時(shí)抑菌活性明顯減弱(P<0.001)，但隨溫度升高變化不明顯，見(jiàn)圖1。

注：與40 ℃比較，*P<0.05，***P<0.001。圖1 溫度對(duì)毛排錢草根正丁醇部位抑菌活性的影響

3.3.2紫外線對(duì)提取物抑菌穩(wěn)定性的影響 由圖2可知，隨著紫外線照射時(shí)間的延長(zhǎng)，毛排錢草根正丁醇部位對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌圈直徑大小作用不明顯；經(jīng)紫外線照射10 min后其對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性降低，且隨著照射時(shí)間的推移，抑菌活性呈持續(xù)降低的趨勢(shì)(P<0.05，P<0.001)。

注：與0 min比較，*P<0.05，***P<0.001。圖2 紫外線對(duì)毛排錢草根正丁醇部位抑菌效果的影響

3.3.3pH對(duì)提取物抑菌穩(wěn)定性的影響 由圖3可知，與pH=5.9比較，在pH=9時(shí)，毛排錢草根正丁醇部位對(duì)敏感菌的抑菌活性較強(qiáng)(P<0.001)；隨著pH的降低，抑菌活性逐漸減弱。當(dāng)pH=11時(shí)，抑菌活性較pH=9時(shí)弱，但強(qiáng)于pH≤7。

注：與pH=5.9比較，*P<0.05，***P<0.001。圖3 pH對(duì)毛排錢草根正丁醇部位抑菌效果的影響

3.3.4金屬離子對(duì)提取物的抑菌穩(wěn)定性影響 由圖4可知，對(duì)于金黃色葡萄球菌，在一定離子濃度下，金屬離子對(duì)毛排錢草根提取物抑菌效果的抑制作用強(qiáng)弱為Fe3+>Ca2+>Na+>K+(P<0.001)；而對(duì)于銅綠假單胞菌，Na+、K+和Ca2+抑制作用強(qiáng)且相似(P<0.001)。

注：與對(duì)照組比較，***P<0.001。圖4 金屬離子對(duì)毛排錢草根正丁醇部位抑菌效果的影響

4 討論

根據(jù)體外抑菌活性的測(cè)定結(jié)果，毛排錢草根、莖、葉均存在不同程度的抑菌活性，其中根的抑菌作用優(yōu)于莖、葉。毛排錢草根不同極性部位對(duì)各菌株的MIC、MBC定量測(cè)定結(jié)果與抑菌圈直徑定性測(cè)定結(jié)果吻合，抑菌活性強(qiáng)弱依次為正丁醇部位>水部位>乙酸乙酯部位>石油醚部位，說(shuō)明抑菌活性成分可能集中在毛排錢草根的正丁醇部位。此外，在對(duì)毛排錢草的化學(xué)成分研究中發(fā)現(xiàn)，其地上部分含有羽扇豆烯酮、羽扇豆醇、白樺醋醇、白樺酸、異香蘭酸、檸檬酚、異檸檬酚、白樺醋酸、原兒茶酸、香橙素、木犀草素等化合物[2，10-12]；而文獻(xiàn)資料亦顯示，白樺醋醇、原兒茶酸、木犀草素等均具不同程度的體外抑菌活性[13-15]，由此推測(cè)，毛排錢草根可能含有上述黃酮類、萜類或生物堿類等成分。在此基礎(chǔ)上，可進(jìn)一步對(duì)毛排錢草根進(jìn)行化學(xué)成分分析，探究其具有抑菌或殺菌活性的單體化合物。

在穩(wěn)定性評(píng)價(jià)結(jié)果中，經(jīng)過(guò)不同溫度加熱處理后，提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果無(wú)明顯變化，對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌活性則明顯減弱，但仍保持一定的敏感性，可能是因?yàn)樘崛∥镏锌梢种聘锾m陰性菌的有效成分中部分不耐高溫，經(jīng)60～80 ℃高溫處理后失去了活性，這與吳少輝等[16]研究結(jié)果基本一致，說(shuō)明提取物具有較好的熱穩(wěn)定性。而隨著紫外線照射時(shí)間的變化，提取物對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌效果變化不明顯，但對(duì)于金黃色葡萄球菌的抑菌活性有所下降，說(shuō)明提取物應(yīng)盡量避光保存。

在不同pH作用下，提取物抑菌活性均出現(xiàn)不同程度的抑制。在實(shí)驗(yàn)設(shè)置的pH條件下，隨著pH的增加，提取物對(duì)敏感菌的抑菌圈直徑均高于對(duì)照組，但當(dāng)pH為11時(shí)抑菌效果出現(xiàn)減弱，說(shuō)明在中性或偏堿性條件下，可能對(duì)提取物有效成分起到了協(xié)同作用，從而抑菌活性得到了增強(qiáng)；當(dāng)環(huán)境pH低于5.9，提取物對(duì)敏感菌的抑菌活性有所下降，說(shuō)明偏酸性條件下可能破壞了提取物的抑菌活性成分，對(duì)抑菌效果產(chǎn)生了抑制。

在Fe3+、Ca2+、Na+、K+等離子作用下，提取物的抑菌活性均受到不同程度的抑制，其中Fe3+對(duì)金黃色葡萄球菌抑制作用較為明顯；在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，加入Fe3+后藥液由酒紅色變?yōu)槟G色并且有少量沉淀產(chǎn)生，該沉淀物可能為主要活性成分與Fe3+離子絡(luò)合形成的。其他金屬離子的加入并未使藥液發(fā)生明顯變化而抑菌效果有所下降，可能是金屬離子的存在改變了細(xì)胞內(nèi)外離子濃度及滲透壓，影響了提取物的作用靶點(diǎn)，從而產(chǎn)生不同的抑制作用，確切原因有待進(jìn)一步研究。