基于“關鍵成分-效應靶點-核心通路”關聯網絡分析的三妙丸治療類風濕性關節炎分子機制研究△

楊強，邱時，戰曉寧，張愛華，高欣，王喜軍

黑龍江中醫藥大學 國家中醫方證代謝組學研究中心 教育部經典名方有效性評價及產業化開發工程研究中心，黑龍江 哈爾濱 150040

中醫學認為關節痛為痹癥，其病機主要是邪氣痹阻經脈。《黃帝內經》對痹病的病因、表現、治療等方面形成了基礎認知。東漢張仲景《傷寒雜病論》中明確將類風濕性關節炎(RA)的經典癥狀稱為“歷節”，而唐宋時期孫思邈的《千金藥方》中已經把“歷節”單獨區分出來。三妙丸出自《醫學正傳》，主治濕熱下注之痿痹，臨床上多用于治療濕熱下注所致的痹病，癥見足膝紅腫熱痛、下肢沉重、小便黃少等。三妙丸由蒼術、牛膝、黃柏3味藥組成，在《中華人民共和國藥典》2015年版[1]中以鹽酸小檗堿等為主要藥效活性成分進行研究，在治療關節炎方面具有一定的藥理作用。中藥方劑具有多成分、多靶點協同效應的作用特點，但目前三妙丸治療RA的整體作用機制尚不完全清楚。網絡關聯分析方法為中藥復方整體作用機制研究提供了新手段。因此，本研究通過構建“關鍵成分-效應靶點-核心通路”關聯網絡分析方法，解析三妙丸治療RA分子作用機制，探索三妙丸的主要活性物質、作用靶點、信號通路及其效應機制，為三妙丸及其類方的有效性評價、效應機制研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 三妙丸藥物活性成分及靶點篩選

分別以“蒼術”“牛膝”“黃柏”為關鍵詞，從中藥系統藥理學分析平臺(TCMSP)、TCMID、ETCM中獲取所有化學成分。將口服生物利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18作為篩選條件，并通過查閱文獻，整理三妙丸組成中藥的抗RA活性成分。結合PubChem得到三妙丸活性成分的吸收、分布、代謝及排泄(ADME)性質。通過治療靶點數據庫TTD(http：//db.idrblab.net/ttd/)、TCMSP、DrugBank (https：//www.drugbank.ca)篩選三妙丸的作用靶點，結合SwissTarget Prediction數據庫靶點預測結果納入分析。通過人類基因和基因表型綜合數據庫OMIM(https：//www.omim.org/)及CTD(http：//ctd.mdibl.org/)數據庫，以“rheumatoid arthritis”為關鍵詞，檢索與RA相關的靶點基因，導出證據來源可靠的相關基因和蛋白靶點。應用Cytoscape軟件，篩選出藥物成分對應靶點與疾病所對應的靶點，并得到兩者的共有靶點，最后將篩選得到的所有靶點名稱輸入UniProt數據庫，并獲得其相應靶點的人源靶點基因名稱。

1.2 網絡構建、拓撲分析及蛋白相互作用(PPI)網絡分析

將篩選得到的三妙丸化學成分相關的靶點、RA相關的靶點連接成“成分-靶點-疾病”網絡。利用Cytoscape 3.7.1軟件將以上網絡進行可視化分析。節點度值反映了網絡節點與其他節點的連接數量，而介數中心度能反映該節點對網絡中其他節點的影響，值越大，則表明該節點在網絡中的作用越大。接近中心度表示不同節點之間的關聯緊密程度。進一步將上述篩選得到的靶點導入STRING數據庫用于搜尋已知蛋白質之間和預測蛋白質之間的相互作用，并結合Cytoscape軟件中MCODE插件進行聚類分析，篩選效應靶標用于“關鍵成分-效應靶點-核心通路”關聯網絡模型的構建。

1.3 GO、KEGG分析及關聯網絡模型的構建

將所得效應靶點導入WebGestalt數據庫進行GO生物學過程分析。將所得效應靶點導入進行KEGG通路分析，篩選三妙丸治療RA的重要通路。將所得效應靶點反向推導出藥物的關鍵成分，并通過對KEGG富集分析結果進一步整合，構建“關鍵成分-效應靶點-核心通路”關聯網絡。

2 結果

2.1 三妙丸主要活性成分的篩選

從中藥系統藥理學分析平臺TCMSP、TCMID、ETCM中共檢索出三妙丸365個化學成分，其中，黃柏140個、蒼術49個、牛膝176個。以OB≥30%和DL≥0.18作為篩選條件獲得66個化合物，通過文獻檢索得到三妙丸中各中藥抗RA活性成分共5個[2-4]，刪除重復化合物后共60個(見表1)。運用CTD數據庫及OMIM數據庫，以“rheumatoid arthritis”為關鍵詞，檢索與RA相關的靶點基因及蛋白共350個，導出證據來源可靠的RA的作用靶點基因。其中槲皮素、β-谷固醇作為黃柏及牛膝的共有成分，推測其在治療類風濕性關節中可能具有重要作用。

表1 三妙丸藥物活性成分

2.2 三妙丸成分及疾病共同直接作用靶點及其拓撲參數

通過治療靶點TTD、TCMSP、DrugBank數據庫篩選三妙丸的作用靶點，結合SwissTarget Prediction數據庫靶點預測結果納入分析，共得到三妙丸活性成分直接作用的靶點622個。通過OMIM及CTD數據庫檢索得到RA相關靶點350個。運用Cytoscape 3.7.1的Merge功能，得到59個共有蛋白靶點(見圖1)，其可能是三妙丸治療RA最相關的蛋白靶點。將所得數據導入Cytoscape 3.7.1構建“三妙丸藥物成分-共有靶點-疾病”關系網絡圖。其中共有101個節點，222條邊，以紅、藍紫、綠分別代表三妙丸藥物活性成分、共有靶點及疾病。在“成分-靶點-疾病”關系網絡圖中能夠清晰的發現藥物成分與靶點蛋白及疾病之間的關系(見圖2)。

圖1 三妙丸藥物活性成分對應靶點與RA靶點韋恩圖

注：綠色代表疾病；紅色代表藥物成分；藍紫色代表靶點蛋白。圖2 三妙丸藥物成分-共有靶點-疾病關聯網絡

2.3 共有靶點PPI網絡構建

將得到的潛在靶點導入STRING數據庫，物種選定為人，獲得蛋白靶點的相互作用網絡(見圖3)，共涉及59個節點，393條邊，平均局部聚類系數為0.626，平均節點度13.3。將String上PPI分析結果下載TSV文件，經Cytoscape軟件MCODE插件進行聚類，得到3個子網絡，并依據MCODE得分高低創建核心子網絡，選擇PPI圖中得分前15位的重要靶點作為后續研究的效應靶標(見表2)。

圖3 三妙丸治療RA作用靶點PPI網絡

表2 三妙丸與類風濕性關節共有靶點聚類分析

2.4 效應靶點PPI網絡構建

將效應靶點基因輸入STRING在線分析平臺，選擇Multiple Proteins選項，在list of Names輸入基因名，在Organism處選擇Homo sapiens得到靶點相互作用PPI數據，導入Cytoscape。共有15個節點，150條邊，平均節點度值為13.3，根據聚類得分，隨著得分的高低，顏色由淺紅逐漸變為深紅(見圖4)。

圖4 三妙丸治療RA效應靶點PPI網絡

2.5 富集分析

2.5.1GO富集分析 為了預測三妙丸治療RA的作用機制，對其進行GO生物過程富集分析。將15個效應靶點導入WebGestalt(http：//www.webgestalt.org/)，進行生物學功能富集，以系統地分析其生物過程。GO富集結果表明，涉及的生物學途徑主要與細胞因子產生調節、細胞因子介導的信號通路、炎癥反應、細胞因子產生及急性期反應等途徑相關，主要集中在代謝途徑、多細胞生物過程、發展過程、對刺激的反應及生物調節等幾大類；在細胞組成上，主要與細胞外空間、質膜的外側等緊密相關，主要集中在細胞外空間及內膜系統幾類；分子功能分析發現細胞因子活性、細胞因子受體結合、信號受體結合等，主要集中在蛋白結合、離子結合等類別(見圖5)。RA發病涉及體內多個生物過程的異常，三妙丸可能是通過多組分、多靶點調節這些生物過程來發揮其治療RA的作用。

圖5 三妙丸效應靶點GO富集分析

2.5.2KEGG富集分析 在WebGestalt中對效應靶點進行KEGG富集分析，共富集到115條通路與三妙丸治療RA的功效相關。發現RA的發病可能與破骨細胞分化(osteoclast differentiation)、Th17細胞分化(Th17 cell differentiation)、T細胞受體信號通路(T cell receptor signaling pathway)和細胞因子-細胞因子受體相互作用(cytokine-cytokine receptor interaction)等途徑緊密相關(見圖6)。在分析過程中發現，效應靶點主要涉及炎癥的產生與發展、免疫系統紊亂等，判斷RA的產生與發展與炎癥、免疫系統紊亂等息息相關。

圖6 三妙丸治療RA效應靶點KEGG富集分析

2.5.3關聯網絡模型的構建 利用效應靶點篩選關鍵成分，共篩選出5個高度關聯成分，分別為小檗堿、黃芩素、槲皮素、吳茱萸次堿、漢黃芩素。將KEGG富集分析結果根據P值篩選，選擇-lgP值較大的5條通路為核心通路，進而構建關鍵成分、效應靶點、核心通路的關聯網絡模型(見圖7)。

圖7 三妙丸治療類風濕性關節炎關鍵成分、效應靶點、核心通路的關聯模型

3 討論

本研究采用網絡藥理分析方法探索三妙丸治療RA的潛在作用機制，為中藥復方治療RA的物質基礎和作用機制研究提供參考。本研究通過網絡數據庫篩選三妙丸藥物活性成分共60個，藥物作用靶點共622個；篩選RA的疾病作用靶點共350個，共有靶點59個。將共有靶點進行聚類分析，篩選效應靶點15個，判斷其為三妙丸治療RA的重要作用靶點。關鍵成分-效應靶點-核心通路模型的構建有利于從分子水平上了解三妙丸治療RA的作用機制。在富集的代謝通路中細胞因子與細胞因子受體的相互作用、IL-17信號通路、T細胞受體信號通路等均對RA的產生具有一定的影響。其中IL-17信號通路主要在多種炎性反應及自身免疫性疾病病理過程中發揮關鍵作用[5-7]。免疫系統能夠對外來病原體進行適當的應答，同時通過一系列復雜的機制來控制對宿主組織的反應。人體內生物信號傳遞紊亂可能導致人類自身免疫性疾病，包括類風濕關節炎等[8]。RA是一種慢性、以炎性滑膜炎為主的系統性疾病。其特征表現為手、足小關節的多關節、對稱性、侵襲性關節炎癥，經常伴有關節外器官受累及血清類風濕因子陽性，可以導致關節畸形及功能喪失，其發病可能與遺傳、感染、性激素等因素有關。

中醫藥在治療RA方面的優勢己逐漸顯現，有相對完備的理論基礎，效果可靠并且不良作用較少，中醫藥能有效降低RA的發病率己逐步得到驗證[9-11]。RA的病理主要有滑膜襯里細胞增生、間質大量炎性細胞浸潤、微血管的新生、血管翳的形成及軟骨和骨組織的破壞等[12-13]。本研究基于關鍵成分-效應靶點-核心通路關聯網絡模型對三妙丸治療RA進行GO及KEGG富集分析，發現三妙丸主要通過TNF、VEGFA、PTGS2、MPO、MMP-2等靶點參與治療RA，主要體現在急性期反應、殼聚糖代謝過程、髓樣白細胞激活等方面。細胞因子貫穿RA的整個病程，致炎性細胞因子和抗炎性細胞因子的不平衡驅動自身免疫反應炎癥的發展，從而導致關節損傷。重要的細胞因子如TNF、VEGF、IL-6、IL-1β在促進關節滑膜細胞增生和炎癥進程中發揮關鍵作用。血管內皮生長因子作為內皮細胞增殖、血管生成和毛細血管通透性的有效介質，在RA的發病機制中發揮著重要作用[14]。TNF是RA發病過程中的主要炎癥介質。研究發現TNF-α通過促進p53乙酰化介導的細胞凋亡而對類風濕關節炎有保護作用[15]。芳香烴受體(AHR)被認為是調節免疫應答的關鍵因素。研究發現，AHR在Th17細胞的發育中起著關鍵作用，而Th17細胞是包括RA在內的多種自身免疫性疾病的關鍵效應T細胞。從而判斷T細胞中的AHR可能通過誘導Th17細胞，在膠原誘導的關節炎的發展中起著重要作用[16]。

網絡藥理分析盡管已在中藥復方作用機制探索方面有一定應用[17-18]，但是其計算模擬生物分子網絡不精準的缺陷依然無法解決。以生物分子網絡理念為精髓，建立表達實證精準分子效應網絡的新方法進而解決中醫藥關鍵科學問題，是未來研究的重要方向。下一步，本課題組進一步聚焦三妙丸治療RA的有效性，以中醫方證代謝組學為核心技術[19-21]，通過獲取三妙丸治療RA的組學效應參數、效應標記物及效應成分等真實數據，整合網絡藥理計算技術，構建解析三妙丸治療RA作用機制的實證分子精準機制網絡，用于精準辨識效應成分解析效應機制，有效規避單純網絡藥理學及計算模擬生物分子網絡準確性不足的缺陷。