菘藍不定芽途徑再生植株研究△

張延紅，何春雨，杜弢，孔繁娟，陳紅剛，曾翠云

甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000

菘藍IsatisindigoticaFort.，又名大青根、北板蘭等，為十字花科菘藍屬植物，以根、葉入藥。其根在中藥上稱板藍根，葉稱大青葉，鮮葉或莖葉加工制成的深藍色粉末稱青黛，三者均為常用中藥，藥性類同，性寒，味苦，具有清熱解毒、涼血消腫之功效[1]。板藍根藥用價值不僅在于治病，更重要在于防病，為40種常用大宗藥材之一，用量很大，在臨床上用途較廣，除板藍根注射液外，常與其他中藥組成復方，廣泛用于治療多種疾病，是醫藥界公認的、具有較好抗病毒效果的中藥之一[2-4]。植物組織培養技術可在短期內快速繁殖植物離體組織，具有快速、高效及可控的特點，便于大規模工業化生產，在藥用植物的快繁及活性成分的高效提取方面具有得天獨厚的優勢。利用組織培養對菘藍進行快速繁殖和高產栽培，對節約耕地，提高產量有重要意義[5-6]。有關菘藍組織培養已有所報道，如通過子葉、幼葉及子房分化芽都獲得成功，但對分化條件及影響因素尚缺乏系統研究[7-10]。不定芽的直接發生途徑是不經過愈傷組織階段直接從芽基部誘導產生芽叢，其再生植株遺傳穩定性高、繁殖速率快，是離體快繁的常用途徑。本試驗以菘藍無菌苗的下胚軸為外植體，探索了不同激素組合與不同濃度配比及不同pH對菘藍不定芽誘導的影響，不定芽的繼代和生根培養，為菘藍優良品種的快速繁殖和新品種選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

SW-CT-IFD型超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)；QHX-300BS-Ⅲ型培養箱(上海新苗醫療器械制造有限公司)；LDZX-30FB型高壓蒸汽滅菌鍋(上海申安醫療器械廠)。

MS粉末(青島高科園海博生物技術)；激動素(KT，天津市凱通化學試劑有限公司，批號：201613)、吲哚乙酸(IAA，上海中泰化學試劑有限公司，批號：2016723)、萘乙酸(NAA，Cooler Science & Technology，批號：CN29163010)、6-芐基腺嘌呤(6-BA，Cooler Science & Technology，批號：CB29152450)、吲哚丁酸(IBA，上海中泰化學試劑有限公司，批號：2016723)、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D，上海中泰化學試劑有限公司，批號：2013125)、蔗糖(天津大茂化學試劑廠，批號：20190618)、乙醇(天津市大茂化學試劑廠，批號：20190705)，氯化汞(HgCl2，天津市大茂化學試劑廠，批號：2018610)、次氯酸鈉(NaClO，天津市大茂化學試劑廠，批號：20190601)，以上藥品試劑均為分析純。

菘藍種子采自甘肅中醫藥大學和政藥用植物園，由甘肅中醫藥大學杜弢教授鑒定為I.indigoticaFort.的種子。

1.2 方法

1.2.1種子滅菌方法選擇 挑選生長飽滿、無病斑的菘藍種子，將剝去果皮的菘藍種子用自來水沖洗，再以蒸餾水沖洗后，用不同的滅菌劑對剝去果皮的菘藍種子于超凈工作臺上進行滅菌處理，接種于 1/2 MS+3%蔗糖+0.75%瓊脂，pH 5.8的培養基上進行培養，每個處理5瓶，每瓶6～8粒種子，20 ℃光照培養，選取最佳滅菌處理組合。

1.2.2外植體的獲得 采用最佳滅菌方法給種子滅菌，待種子發芽長出幼苗(約6 d后)，挑選長勢良好的無菌苗，以下胚軸為外植體。

1.2.3不同激素種類和濃度配比誘導產生不定芽 以 MS為基本培養基，其中添加3%蔗糖，0.7%瓊脂，培養基pH 5.8，研究不同激素濃度配比的KT和IAA、KT和NAA、KT和IBA、BA和IAA、BA和NAA或單獨添加2，4-D對不定芽誘導或愈傷組織的影響。

1.2.4不同pH對不定芽誘導的影響 以下胚軸為外植體，以MS+6-BA 1.0 mg·L-1+IAA 0.5 mg·L-1+3%蔗糖+0.7%瓊脂為培養基，研究不同pH(5.0、5.4、5.8、6.2、6.6)對菘藍不定芽誘導的影響。

1.2.5不同激素配比和濃度對不定芽生根的影響 將誘導獲得的菘藍不定芽接種于1/2 MS培養基，附加不同濃度IBA或IBA和IAA配比使用，觀察統計生根情況。

1.2.6培養條件和統計指標 每個處理4瓶，每瓶接種3個外植體，培養箱溫度25 ℃，光照條件1500～2000 Lux。培養30 d后觀察統計不定芽誘導率、葉形、芽高、芽顏色、芽數量、芽增殖系數等指標。

2 結果與分析

2.1 外植體不同滅菌方法比較

由表1可知，HgCl2滅菌效果顯著好于NaClO。2%NaClO滅菌 5 min污染率高達 88.40%，滅菌10 min后污染率降至67.52%。0.1%HgCl2滅菌3 min污染率達55.0%，隨著滅菌時間的延長污染率降低，滅菌 5 min污染率降低至7.2%。因此，選擇0.1%HgCl2滅菌5 min為菘藍種子最佳滅菌處理。

表1 不同滅菌劑和滅菌時間對菘藍種子污染率的影響

2.2 不同種類和濃度配比的外源激素對不定芽誘導的影響

2.2.1不同質量濃度 6-BA和IAA配比對不定芽誘導的影響 在不同質量濃度配比的6-BA和IAA培養基中(見表2)，6-BA的質量濃度過低(0.5 mg·L-1)時，芽高和芽的誘導率均不高，不定芽的生長勢細弱。當6-BA的質量濃度為1.0 mg·L-1時，不定芽增高，生長勢健壯，芽的誘導率顯著增加。隨著6-BA質量濃度的增加(2.0 mg·L-1)，芽的誘導率顯著降低，芽短小，生長勢一般。在1.0 mg·L-16-BA和0.5 mg·L-1IAA的激素配比中芽的誘導率最高為75%，不定芽數量多，芽高1.5 cm，生長勢健壯，是適宜的不定芽誘導培養基(見圖1)。該培養基可作為繼代培養基，進一步考察芽的增殖和生長情況。

表2 不同質量濃度6-BA和IAA配比對菘藍下胚軸誘導不定芽的影響

圖1 胚軸誘導產生少量叢生芽

2.2.2不同質量濃度6-BA和NAA配比對不定芽誘導的影響 由表3可知，在添加不同質量濃度6-BA 和NAA的培養基中，當6-BA質量濃度從0.5 mg·L-1增大到2.0 mg·L-1時，芽的誘導率先增大后減小，表明6-BA質量濃度過高或過低都不利于芽的誘導。當6-BA 1.0 mg ·L-1和NAA 0.5 mg·L-1配比時，誘導出的不定芽顯著好于其他處理，芽高1.0 cm，芽誘導率為77.7%，且生長勢健壯。因此，該激素處理可作為適宜的不定芽誘導培養基。

表3 不同質量濃度6-BA和NAA配比對菘藍下胚軸誘導不定芽的影響

2.2.3不同質量濃度KT與IAA配比對菘藍不定芽誘導的影響 由表4可知，以胚軸為外植體，以MS為基本培養基，添加不同質量濃度KT、IAA，菘藍下胚軸兩端和表面可直接誘導產生不定芽。在IAA質量濃度一定時，高濃度KT不定芽的誘導率與芽數量普遍高于低濃度KT。KT一定時，高濃度IAA不定芽的誘導率普遍高于低濃度IAA的誘導率。高濃度KT處理中不定芽顏色大多呈綠色，芽較高，生長勢較好。低濃度KT處理下，不定芽大多呈黃褐色，芽較短，生長勢較差。此外，在0.5 mg·L-1KT與0.2 mg·L-1IAA培養基中不定芽有枯死現象。因此，采用高濃度KT與IAA配比更有利于不定芽的誘導和生長，最適質量濃度配比為2.0 mg·L-1KT與0.8 mg·L-1IAA，誘導率達100%。

表4 不同質量濃度KT與IAA配比對菘藍下胚軸誘導不定芽的影響

2.2.4不同質量濃度KT與NAA配比對菘藍不定芽誘導的影響 由表5可知，以胚軸為外植體，菘藍下胚軸切口和表面可直接誘導產生不定芽，高濃度NAA培養基中不定芽的誘導率較低濃度高。高濃度KT培養基中芽較高，多呈淡綠色。低濃度KT，芽較矮，多呈黃綠色。KT 1.0 mg·L-1與NAA 0.8 mg·L-1培養基中雖然芽的誘導率達100%，但芽的生長勢一般?？傮w而言，以胚軸作外植體，KT和NAA不同濃度配比使用，誘導不定芽效果不良。

表5 不同質量濃度KT與NAA配比對菘藍下胚軸不定芽誘導的影響

2.2.5不同質量濃度2，4-D對菘藍下胚軸愈傷組織誘導的影響 由表6可知，2，4-D對愈傷組織誘導效果比較好，低濃度2，4-D的誘導率比高濃度2，4-D高，且最適誘導質量濃度為1.5 mg·L-1，誘導率最高可達100%。從愈傷組織顏色來看，低濃度2，4-D下呈黃綠色致密狀，高濃度2，4-D下呈淡黃色致密狀，愈傷部位均在下胚軸切口端(見圖2)。

表6 不同質量濃度2，4-D對菘藍下胚軸愈傷組織的誘導情況

圖2 2，4-D誘導胚軸產生愈傷組織

2.3不同pH對誘導菘藍不定芽誘導的影響

將菘藍下胚軸培養在不同pH的培養基上，30 d后觀察統計(見表7)。pH為5.4時叢生芽生長良好，芽誘導率高，并且葉片舒展，葉緣光滑，pH為6.2和6.6時葉皺縮、葉緣有鋸齒、有玻璃化現象，葉片呈水浸狀，葉片淡綠色。

表7 不同pH對菘藍下胚軸不定芽誘導的影響

2.4 不定芽的繼代培養

將MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1培養基中誘導獲得的不定芽，在原培養基中進行繼代培養，不定芽增殖系數為5，生長勢良好(見圖3)。

圖3 叢生芽的增殖培養

2.5 生根培養

由表8可知，在培養基中加入不同質量濃度IBA誘導生根，IBA質量濃度高或低均不利于生根，根誘導率顯著降低，根和芽的生長勢一般或細弱。當IBA的質量濃度為1.0 mg·L-1時，生根率達100%，且平均根長為6.0 cm，根和芽生長勢健壯。當IAA質量濃度為2.0 mg·L-1時，隨著IBA濃度增加，生根率先增大后減小，其中IAA 2.0 mg·L-1和IBA 1.0 mg·L-1配比使用，生根率達到85.4%，根的生長勢健壯，但芽的長勢一般。其他處理生根率較低，根和芽的生長勢一般。由此可見，1/2 MS+IBA 1.0 mg·L-1是最佳生根培養基(見圖4)。

表8 不同種類和質量濃度生長素對菘藍不定芽生根的影響

圖4 生根的試管苗

3 討論

本研究以胚軸為外植體，通過添加不同種類和濃度的激素組合的培養基，得到了很高的芽誘導率和生根率。胚軸產生不定芽能力很強，可以從胚軸兩端切口和胚軸表面直接產生不定芽，該植株再生途徑遺傳穩定性較高，是一種較理想的離體快繁途徑。陳薇等[9]的研究結果也表明，胚軸的不定芽分化較早，培養6～7 d 即可發生。在此過程中，沒有愈傷組織的產生，直接產生不定芽。

植物生長調節劑是調控植物形態發生的關鍵性因素，其不同的種類和濃度對器官發生的影響不同。從培養過程中的觀察和統計結果來看，菘藍下胚軸切口甚至表面容易誘導產生不定芽，但外源激素種類和濃度不同，不定芽誘導率、芽高、芽數量和生長勢有所不同。胡冬南等[10]研究了不同激素組合(6-BA、NAA、IAA)對菘藍葉片組織培養的誘導影響，其結果表明，6-BA 1.5 mg·L-1+ NAA 0.6 mg·L-1和6-BA2.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1的不定芽分化率較高，可達90%。本研究以胚軸為外植體，結果表明，6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1誘導率僅為13.3%，但6-BA 1.0 mg·L-1+ NAA 0.5 mg·L-1配比取得了良好的誘導效果，芽誘導率為77.7%，芽生長健壯，其原因可能是不同外植體其體內的內源激素含量不同，培養時對外源激素的需求量不同。本研究結果還表明，6-BA 1.0 mg·L-1+IAA 0.5 mg·L-1和KT 2.0 mg·L-1+IAA 0.8 mg·L-1也是適宜的激素組合。但KT與NAA配比誘導效果普遍不好。

有研究報道表明，單獨使用0.1 mg·L-1NAA的生根率達90%以上且生根效果較佳，而過高濃度則抑制生根[10]。本研究使用1.0 mg·L-1IBA的生根率達100%，高濃度IBA對生根會表現出抑制作用。由此可見，在使用不同生長素進行菘藍不定芽生根時，采用NAA時所需濃度比較低，采用IBA時所需濃度較高，且可以誘導獲得更高的生根率。但生長素濃度過高時均會抑制根的發生。