基于譜效關聯技術的中藥研究現狀△

晏朝操，張建鋒

1.德江縣民族中醫院，貴州 銅仁 565299；2.國藥集團同濟堂(貴州)制藥有限公司，貴州 貴陽 550009

中藥無論是單味藥還是中藥復方，其成分繁多而復雜，中藥化學成分不及化學藥清楚明確。在國內外，中藥指紋圖譜被認為是一種切實可行的質量控制方法，整體上很好地控制中藥的質量。如何保證中藥的臨床療效呢？衛強等[1]在總結前人基礎上提出，將中藥指紋圖譜中化學成分的變化與中藥藥效結果聯系起來，建立中藥化學成分與其療效一致的中藥質量標準。有學者又在其基礎上將中藥指紋圖譜和藥效結合起來進行研究，建立了譜效關聯學[2]、譜效關系學[3]、中藥譜效學[4]等學科。中藥譜效學是在中醫藥理論現代研究的基礎上，以中藥指紋圖譜為基礎，以效應及效應體學為主要內容，從中藥指紋圖譜的多種(或多組)化合物中，應用生物信息學方法，建立中藥指紋圖譜與中藥質量療效內在研究關系的一門學科[5-7]，廣泛應用于中藥材、中藥飲片和中藥制劑質量評價研究(見表1)。

表1 譜效關聯技術在中藥評價研究中的應用

1 中藥指紋圖譜與藥效的研究

迄今為止，國內外研究者對譜效關聯進行了大量的實驗探索。肖云芝等[23]采用高效液相色譜-二極管陣列檢測(HPLC-DAD) 測定了12個產地鱉甲藥材樣品，研究其對LX-2細胞的抑制效果，發現12個產地鱉甲藥材HPLC指紋圖譜中共有7個特征共有峰，其中峰2、5與LX-2 細胞抑制效果(A 值)呈現中等程度相關，峰4的相關性最強；并建立了共有模式，進行PCA，峰4的量對鱉甲質量有著重要的影響。高燕等[24]根據 10批金銀花樣品的驗證結果建立數學模型，半數有效濃度(EC50)計算值與實測值偏差率全部在10%以內，其中7個模型(占70%)的偏差率在5%以內。Zeng等[25]通過氣質聯用(GC-MS)建立廣西莪術揮發油指紋圖譜，并對廣西莪術揮發油的抗腫瘤作用進行研究，在獲得的揮發油GC-MS 指紋圖譜特征峰面積與對鼻咽癌細胞的增殖抑制作用數據的基礎上，確定了廣西莪術揮發油“有效組分群”指紋特征對藥效貢獻的大小，為中藥譜效關聯的建立、中藥質量控制和藥效評價標準的制定提供了新的思路和方法。

2 譜效關聯的研究內容和方法

2.1 單味中藥物質基礎研究

在中藥研究中，單獨使用某一成分含量作為單味藥的質量控制指標，具有片面性。根據單味中藥研究目標不同，包括產地、種屬、季節、藥用部位、提取方法、檢測方法、炮制方法等差異性的藥材作為研究對象，將指紋圖譜和藥效學實驗數據相結合，運用數理統計學的知識，分析中藥的化學成分與藥效的關聯性。王宏虹等[26]以人肝癌細胞株HepG2為藥效模型，應用噻唑藍比色法(MTT)測定33批不同產地兩面針藥材提取物的抗肝癌活性，采用逐步后退法將量化特征峰面積與MTT 法測得兩面針提取物抗腫瘤活性的結果結合，構建兩面針藥材提取物抗肝癌的譜效關系方程，可較準確地預測兩面針藥材提取物的抗肝癌活性。Xiao等[27]利用超高效液相色譜-質譜結合指紋圖譜研究鐵莧屬藥材的抗菌活性，該模式為中藥研究提供新的研究方法和思路。

2.2 中藥復方物質基礎研究

由于中藥復方藥味較多，化學成分復雜，其不同于單味中藥的物質基礎研究，有自己獨特的研究方式和方法，采用拆方進行研究，主要有單味藥研法、撇藥分析、分組研究、據有效部位或成分的分組研究、配伍研究、應用數理原理指導拆方研究等思路和方法[28]。多以不同產地、不同炮制、不同配伍組合或不同提取方法制備的復方作為研究對象，進行指紋圖譜研究和藥效學研究，再通過多種統計分析方法進行數據處理，建立譜效關系模型，確定復方中的主要活性成分群。劉青萍[29]運用PCA和GRA對實驗結果進行分析，發現腦健片和補陽還五湯樣品共有峰排名均大于其各自的特有峰，且保留時間為20.649、6.474、26.404 min的化學成分對神經功能評分、腦梗死面積、腦干濕比、周期蛋白Cyclin B1和Cyclin B2的貢獻度排在前5位。李金兵[30]運用GC-MS法及多種關聯分析法，成功尋找到11個抗抑郁的活性成分(莰烯、蒼術酮、藁本內酯、棕櫚酸、白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅱ等)，從而為逍遙散的質量控制與藥效物質基礎研究提供了有價值的參考。

2.3 譜效關聯與其他方法相結合

譜效關聯與一測多評法和化學計量學等方法結合，進行指紋圖譜和藥效學研究。李婷婷等[31]在現有的中藥材質量控制研究方法的基礎上，提出“譜效關系+一測多評”的研究思路，即將譜效關系與一測多評相結合，為中藥材質量控制研究提供方法和新思路。林芳等[32]應用一測多評法以綠原酸為參照內標，通過相對校正因子對松脂醇二葡萄糖苷、綠原酸、京尼平甘酸進行含量測定，并建立杜仲多指標HPLC指紋圖譜，標定了12個共有指紋峰，為更全面科學地評價杜仲藥材質量提供技術支撐。段小菊[33]利用化學計量學方法，分別建立了基于HPLC指紋圖譜和近紅外光譜(NIR)指紋圖譜與抗氧化活性之間的白花丹參譜效關系模型，挖掘與抗氧化活性有顯著相關的特征峰或光譜特征信息，為白花丹參藥材的質量控制和評價提供參考。

3 譜效關聯的數據處理方法

3.1 相關分析

相關分析研究現象之間是否存在某種依存關系，并對具體有依存關系的現象探討其相關方向以及相關程度，是研究隨機變量之間相關關系的一種統計方法[34]。張靜等[35]采用結扎大鼠冠狀動脈致急性心肌缺血的模型，運用雙變量相關分析(BCA)和多元回歸分析(MRA)，將超臨界提取物(AC-SFE)與紅花各配伍組合的藥效數據與指紋圖譜共有峰的相對峰面積相關聯，并采用LC-MS指認色譜峰。共指認出16個色譜峰，其中12個是相關峰。AC-SFE 中的阿魏酸(峰13)、洋川芎內酯H(峰15)等峰可能是抗心肌缺血的藥效物質；而峰8可能不能緩解心肌缺血。鄭林等[36]研究葒草中花穗、帶葉嫩枝和粗莖對H2O2誘導心肌H9c2細胞氧化損傷的保護作用，探討其抗心肌缺血的藥效物質基礎；將各組合物活性信息與其相應的UPLC指紋圖譜化學信息進行相關性分析研究，推測藥效物質基礎。通過譜效研究推測了葒草抗氧化損傷的活性成分，為葒草藥材深層次研究開發奠定一定的實驗基礎。中藥譜效關聯研究主要是針對中藥指紋圖譜與藥效兩變量之間的關系，故常使用雙變量相關性分析進行研究，適合從不嚴格的數據關系中判斷其關系的緊密程度。

3.2 回歸分析

回歸分析是確定2種或2種以上變量間相互依賴的定量關系的一種統計分析方法，運用十分廣泛。回歸分析按照涉及的自變量的多少，可分為一元回歸分析和多元回歸分析；按照自變量和因變量之間的關系類型，可分為線性回歸分析和非線性回歸分析[37]。李友等[38]采用動態濁度法和HPLC獲取板藍根三氯甲烷部位指紋圖譜，應用多元線性回歸等統計方法，將抗內毒素活性參數半數抑制濃度(IC50)與HPLC指紋圖譜共有峰的標準化峰面積比值相關聯。李鵬等[39]采用小鼠痛經模型并結合GC-MS，對桃紅四物湯及其單味藥石油醚部位進行篩選；桃紅四物湯的石油醚部位有顯著的調經止痛作用。桃紅四物湯的親脂性化學成分主要為脂肪酸類成分。運用回歸分析與相關分析對23號峰、24號峰(十八碳烯酸)、45號峰(花生酸)和61號峰(二十七烷)進行研究，發現亞油酸在延長扭體潛伏期和減少扭體次數方面起主要作用，而其他3個峰對鎮痛效果有一定的協同作用，在一定程度上較客觀地分析化學物質與藥效之間的關系。回歸分析是定量描述自變量對因變量的貢獻率，回歸系數越大影響越大，反之越小。在研究應用中，中藥譜效關聯多運用多元綜合分析方法。

3.3 成分分析

PCA是將多個變量通過線性變換以選出較少個數重要變量的一種多元統計分析方法。又稱主分量分析。胡曉燕等[40]采用管碟法，以抑菌系數作為評價指標，檢測板藍根總提取物、總有機酸部位、總生物堿部位、總核苷部位、總蒽醌部位對大腸桿菌AG100A 的抑制作用，確定抑菌活性最強部位后，建立10 批不同產地板藍根樣品的HPLC 指紋圖譜，應用PCA將HPLC 指紋圖譜共有峰的峰面積與抑菌系數進行相關分析。Kong等[41]利用PCA、HCA與多元相關分析方法，分別建立了基于HPLC指紋圖譜與抗抗菌之間的板藍根的乙酸乙酯提取物譜效關系模型，挖掘與抗菌性有顯著相關的特征峰或光譜特征信息，為板藍根藥材的質量控制和評價提供新方法。在譜效關聯研究中，適合先采用PCA篩選出主要藥效組分，再結合其他數據處理方法進行研究。

3.4 灰色關聯分析

對2個系統之間的因素，其隨時間或不同對象而變化的關聯性大小的量度，稱關聯度。在系統發展過程中，如果2個因素變化的趨勢存在一致性，即同步變化程度較高，可謂兩者關聯程度較高；反之，較低。因此，GRA是指因素之間發展趨勢的相似或相異程度，亦稱“灰色關聯度”，看成衡量因素間關聯程度的一種方法[42]。耿媛媛等[43]采用HPLC建立二神丸不同提取部位的指紋圖譜，以不同提取部位對番瀉葉所致急性腹瀉小鼠腹瀉指數的影響研究其止瀉作用，采用GRA法建立其譜效關系，建立的二神丸不同提取部位高效液相色譜指紋圖譜方法較簡單，易重復，為更好評價二神丸的質量提供參考。楊英來等[44]用控食和疲勞的方法制備小鼠氣虛模型，比較當歸不同提取部位對氣虛小鼠單核巨噬細胞的吞噬功能及免疫器官等的影響，篩選當歸補氣藥效部位；用GRA法將補氣作用較佳的各批當歸藥材70%乙醇提取部位(醇提物)HPLC 特征圖譜各共有峰的峰面積與補氣藥效數據相關聯，研究譜效相關性。如果中藥的組分缺失信息比較多，適合運用GRA進行研究，與其他的分析方法比較，GRA要求的數據少，對數據的要求較低，原理簡單，易于掌握和理解。

4 譜效關聯的發展前景

4.1 采用現代的分析技術

中醫藥譜效關聯的研究是目前中醫藥研究行業的一個熱點，是中醫藥研究倡導的新思想。采用現代分析技術，是實現中藥指紋圖譜完成化學成分分離、結構鑒定的重要手段，也是對譜效關聯研究的必要方法，如采用GC-MS[45]、多種液質聯用技術[高效液相色譜-串聯質譜法(HPLC-MS/MS)[46]、HPLC-DAD[47]、高效液相色譜-蒸發光散射法(HPLC-ELSD)[48]、高效液相色譜-四級桿飛行時間串聯質譜法(HPLC-Q-TOF-MS)[49]、超高效液相色譜-四級桿-飛行時間串聯質譜法(UPLC-Q-TOF-MS)[50]、超高效液相色譜-離子阱/飛行時間質譜法(UPLC-IT-TOF-MS)[51]等。經過對中藥化學成分進行分離鑒定之后，再結合譜效關系的研究方法，確定中藥的物質基礎群或者有效組分群。

4.2 應用合理的數據處理方法

在中藥譜效關聯的研究中，選擇科學合理數據處理方法極為重要，譜效關聯研究的核心內容是合理的數據處理方法。在中藥譜效關聯的研究過程中，包括PCA、相關分析、逐步后退法、GRA、回歸分析、神經網絡分析、化學計量學與計算機編程模擬等數據處理方法；數據挖掘技術也是作為一個從海量數據中獲取知識的有力工具，采用合理的數據挖掘模型及算法，能有效地推動中醫藥信息化的進程。每一個方法都有其優點和局限性，合理利用每個方法的優點，避免其局限性，才是中醫藥研究的關鍵所在。

4.3 選擇有針對性的藥理模型

在研究過程中，選擇合理的藥理模型對于藥效研究更為重要，中藥藥理研究有較多模型，如抗炎、鎮痛、抗高血壓、抗胃潰瘍、免疫性肝炎模型等。不同的藥理模型得到不同的藥效實驗數據。合理的藥理模型，能很好地指導藥效研究。藥理模型在研究過程中，研究對象不要選擇離體的組織或者器官，最好選擇整體動物，評價藥效更加客觀、合理、全面。將中藥譜效結合血清藥物化學[52]、代謝組學[53]、蛋白組學[54]等新興學科，能夠使研究成果更加規范、合理，使譜效關聯更加科學、真實、可靠。

4.4 譜效關聯的前景

譜效關聯是指紋圖譜研究深層次的科學研究模式，其是將中藥藥效與指紋圖譜緊密結合建立的中藥體內質量的指紋圖譜，為中藥復方制劑藥效物質的研究和探索提供新思路、新方法；同時，可以整體反映中藥多成分和生物活性成分數據信息，提高中藥及復方制劑的質量評價標準，闡釋中藥化學成分與藥效之間的關系，為建立系統全面的中藥譜效關系模型提供理論依據，具有非常重要的理論與現實意義。但該方法研究仍有一定的局限性，隨著科技進步和中醫藥迅速發展將不斷對其進行補充和完善。伴隨著多學科的交叉與融合，數據處理技術和檢測方法有日新月異的發展，譜效關聯技術對解釋中藥物質基礎、提取分離、藥效篩選等方面貢獻卓著，為推動中醫藥標準化、現代化和國際化奠定堅實基礎。