安徽結香花蕾中總黃酮的含量測定

班超，秦亞東*，李林華,2

(1. 安徽中醫藥高等專科學校，安徽 蕪湖 241002；2. 安徽中藥資源研究所, 安徽 蕪湖 241317)

瑞香科植物結香(EdegeworthiachrysanthaLindl.)的花蕾、根和莖皮均可入藥[1]。其花蕾為廣西等地區的民族藥物，是瑤族經典老班藥物“五虎、五牛、十八鉆、七十二風”中風類的常用代表藥材，尤其是在瑤族地區有悠久的藥用歷史，別名夢花、新蒙花等，具有養陰安神，明目，祛障之功[1-3]，因結香花蕾與中藥材密蒙花的性狀以及藥用價值較為相似，常作為密蒙花的替代品[2]。

現代藥理研究證實結香花提取物均有明確的藥理活性，如抗菌作用[4]，抗氧化[5]等作用；化學成分以香豆素和黃酮類化合物為主[6]，如蘆丁、銀椴苷、山奈酚-3-O-吡喃葡萄糖苷等黃酮類化合物[7]。眾所周知，藥用植物中黃酮類化合物具有廣泛而明確的藥理作用，也是中藥材發揮藥效作用的主要化學類型之一，常作為藥材質量控制指標。由于民族藥物開發研究緩慢，目前針對結香花中的總黃酮含量研究極為罕見，為提高作為藥材的結香花質量標準，采用紫外分光光度法建立了安徽不同產地結香花中總黃酮的含量測定方法，本方法測定結果準確、穩定、重復性好、簡便可行，為結香花的質量控制提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Cary60型紫外分光光度計(美國Agilent公司)；DV215CD型十萬分之一精密電子天平(美國Ohaus公司)；FA1204N型JK-250DB型萬分之一精密電子天平(上海民橋精密科學儀器有限公司)；超聲波清洗儀(合肥金尼克機械制造有限公司)；Minispin型臺式離心機(德國Eppendorf公司)。

1.2 材料

結香花采自安徽省內六安市、安慶市等地區，采集時間為2019年1～2月份。新鮮花蕾經安徽中藥資源研究所汪榮斌教授鑒定為瑞香科結香屬植物結香 (EdegeworthiachrysanthaLindl.)的花蕾；蘆丁對照品(批號：100080-201907)和D-無水葡萄糖對照品(批號：110833-201809)均購自中國食品藥品檢定研究院；亞硝酸鈉、硝酸鋁、無水乙醇和強氧化鈉等試劑均為市售分析純。

表1 結香花樣品信息表

2 方法與結果

2.1 溶液的配制

2.1.1 蘆丁對照品溶液的配制。精密稱取干燥至恒重的蘆丁對照品0.0160 g，以無水乙醇為溶劑，轉移至100 mL容量瓶中，用無水乙醇定容至刻度，搖勻，即得濃度為0.16 mg/mL蘆丁對照品溶液，置4 ℃冰箱中，備用。

2.1.2 NaOH溶液的配制。準確稱取NaOH固體4.0 g，以蒸餾水溶解后轉移至100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，即得濃度為4%的NaOH溶液。

2.1.3 NaNO2溶液的配制。準確稱取NaNO2固體5.0 g，以蒸餾水溶解后轉移至100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，即得濃度為5%的NaNO2溶液。

2.1.4 硝酸鋁溶液的配制。準確稱取Al(NO3)3·9H2O固體17.6 g，以蒸餾水溶解后轉移至100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，即得濃度為10%的Al(NO3)3溶液。

2.2 結香花供試品溶液的制備

新鮮結香花置于通風處自然晾干后，稱取結香花干燥樣品10.0 g置于圓底燒瓶中，加80%乙醇100 mL回流提取0.5 h，放冷至室溫后濾過，濾渣中繼續加入150 mL的80%乙醇100 mL再次回流提取0.5 h，放冷至室溫后濾過，合并二次提取的濾液，定容至200 mL容量瓶中，置4 ℃冰箱中，備用。

2.3 總黃酮顯色方法

參考文獻方法[8-9]，對部分條件稍作調整，具體為：精密量取結香花供試品溶液和蘆丁對照品溶液各1.00 mL分別轉至2個10 mL容量瓶中，加入80%乙醇4.00 mL，搖勻后加入4% NaNO2溶液0.4 mL，搖勻后靜置6 min后，加入10%的Al(NO3)3溶液0.5 mL，搖勻后靜置6 min后，加入4%的NaOH溶液4 mL，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，靜置15 min，即可。以80%乙醇溶液為空白，分別將顯色后的樣品溶液和蘆丁對照品溶液于400～760 nm掃描，結果發現，最大吸收波長在510 nm附近，故確定測定波長為510 nm。

2.4 方法學考查

2.4.1 線性范圍的考查。分別精密量取蘆丁對照品溶液(0.16 mg/mL)0.20、0.40、0.80、1.20、1.60 mL置于6個10 mL容量瓶中，其余操作按“2.3”項下方法進行，以80%乙醇溶液為空白，于510 nm波長下測定吸光度(A)值，以蘆丁對照品濃度對吸光度A進行線性回歸，線性回歸方程為：A=6.52142×C-0.00021，R2=0.9995，說明蘆丁在0.0032～0.0256 mg/mL濃度范圍內與吸光度A呈良好的線性關系。

圖1 蘆丁對照品工作曲線圖

2.4.2 精密度考查。取蘆丁對照品溶液0.40 mL，按“2.3”項下方法進行顯色處理，在510 nm下連續測定吸光度A值6次，結果相對標準偏差(RSD)為0.57%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復性考查。稱取6份干燥結香花樣品各10.0 g，按“2.2”項下方法提取結香花樣品中總黃酮，按“2.3”項下顯色方法進行顯色，所得6份結香花樣品溶液分別于510 nm下測定吸光度A值，空白溶液為80%乙醇，結果6份樣品吸光度A的RSD為1.43%(n=6)，說明所建立方法重復性良好。

2.4.4 穩定性試驗。稱取干燥結香花樣品10.0 g，按“2.2”項下方法提取結香花樣品中總黃酮，按“2.3”項下顯色方法進行顯色，所得結香花樣品溶液分別于0、0.25、0.5、1、1.5、2 h 測定吸光度A值，結果吸光度A值RSD為0.86%(n=6)，表明結香花供試品溶液在2 h內穩定。

2.4.5 加樣回收率試驗。精密稱取9份已知總黃酮含量的同一產地來源干燥結香花樣品溶液1.00 g，分布精密加入蘆丁對照品溶液等量，按“2.2”項下方法提取結香花樣品中總黃酮，所加提取溶劑按料液比為1∶10進行，其余操作相同，按“2.3”項下顯色方法進行顯色，以80%的乙醇溶液為空白，于510 nm波長下測定吸光度，代入線性回歸方程計算加樣回收率。結果見表2，總黃酮平均加樣回收率為 96.27%，RSD為0.55%(n=9)，表明該方法測定結果準確可靠。

表2 樣品中總黃酮含量(%)

2.5 樣品含量測定

精密稱取安徽不同產地來源的干燥結香花樣品各約10 g，按“2.2”項下方法提取結香花樣品中總黃酮，其余操作相同，按“2.3”項下顯色方法進行顯色，以80%的乙醇溶液為空白，于510 nm波長下測定吸光度，代入線性回歸方程計算各個產地樣品中總黃酮含量。結果表明，安徽不同產地來源結香花樣品中總黃酮含量在5.07%～8.61%，反映出安徽產結香花樣品總黃酮含量相對均一穩定。

3 討論

3.1 提取條件的優化，預試驗中對提取溶劑、提取方式等進行了單因素考查。對水、甲醇、乙醇3種常用提取溶劑進行了考查，考慮到水為提取溶劑時提取溫度較高，容易導致黃酮類化合物發生氧化等反應，而甲醇毒性較大，因此選擇乙醇為提取溶劑，分別設計40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇和無水乙醇為溶劑進行單因素試驗考查，結果發現80%乙醇為提取溶劑時總黃酮含量較高，因此，本試驗選擇以80%乙醇為結香花樣品總黃酮提取溶劑；同時對回流提取、超聲提取、滲漉提取方式進行了單因素考查，結果發現超聲提取效率較低，可能是由于干燥結香花樣品溶劑難以浸潤有關，滲漉提取率較高，但耗費時間明顯長于回流提取法，因此，本試驗選擇回流提取方式，提取2次后，繼續回流提取，總黃酮含量未見明顯升高，因此提取次數確定為2次；料液比也進行了單因素考查，料液比為1∶10時可以充分提取結香花中的總黃酮，繼續提高料液比對總黃酮提取沒有顯著區別。

3.2 本試驗參考相關文獻報道，建立了安徽產結香花中總黃酮的含量測定方法，試驗結果表明，該方法測定結果準確可靠、精密度和重復性良好、回收率高，操作簡便易行，適用于安徽產結香花中總黃酮的含量測定。結果顯示收集于安徽8個產地的結香花樣品中總黃酮的含量介于5.07%～8.61%，表明安徽產結香花中總黃酮含量較為穩定，可用于安徽產結香花藥材的質量控制。