長期施用沼液對檳榔芋根際土壤真菌群落多樣性的影響

劉蘭英，黃 薇，呂 新，何肖云，陳麗華，李玥仁

（福建省農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所/福建省農產品質量安全重點實驗室，福建 福州 350003）

0 引言

【研究意義】近年來，隨著畜禽養殖業的不斷發展，畜禽廢棄物的產量越來越大，沼氣工程為處理畜禽養殖場廢棄物提供了有效手段[1]。沼液是厭氧發酵后的副產物，含有豐富的營養元素，多以速效性及水溶性狀態存在，易被作物吸收利用，是一種優質的有機肥料[2]。沼液施肥后可以增強土壤肥力，在提高作物產量、改善品質和防病抗逆等方面發揮重要作用[3]。通過沼液還田利用可以有效解決沼液的消納問題，已成為當前畜禽養殖廢棄物資源化利用的重要途徑[4]。農業農村部在2018 年重點推廣的十大類型生態農業模式中，就有4 類模式涉及沼液還田利用。沼液進入農田后會引起土壤環境發生系列改變，包括土壤的營養結構、土壤中重金屬的形態和含量、土壤酸堿環境等，而土壤微生物能夠敏感地反映出土壤環境的變化，是評價土壤質量的主要指標之一[5]。因此，研究沼液施肥對農田土壤微生物群落及微生態環境的影響，對于評價土壤質量演變、制定科學沼液還田方案具有重要的指導意義。【前人研究進展】目前關于沼液還田影響土壤微生物的研究主要集中在土壤微生物群落代謝功能多樣性、土壤微生物數量、土壤細菌群落特征等方面。鄭學博等[6]對旱地紅壤的研究表明，沼液還田顯著影響旱地紅壤微生物群落的代謝活性和多樣性。馮丹妮等[7]對水旱輪作耕層土壤的研究表明，長期沼液還田有利于土壤微生物數量和酶活性的提高，但對土壤微生態平衡及土壤質量存在潛在威脅。朱金山等[8]對稻田土壤的研究表明，不同沼液還田年限下稻田耕層土壤細菌群落組成及多樣性均發生了明顯變化。【本研究切入點】在眾多研究中，有關沼液還田對土壤真菌群落特征影響的研究卻較少報道。土壤真菌作為土壤微生物中主要的類群之一，是土壤中有機物的重要分解者，在陸地生態系統養分循環中發揮著重要作用，真菌多樣性及其群落結構的變化是評價其所在生態系統健康穩定的關鍵性指標之一[9?10]。【擬解決的關鍵問題】為此，本文基于高通量測序技術，對采自連續施用沼液6 年和未施用沼液的檳榔芋種植地塊土壤真菌多樣性及群落結構進行研究，探討沼液施用對土壤真菌群落特征的影響，以及土壤真菌對由沼液施用引起的土壤理化性質變化的響應，為促進沼液資源化利用，維持畜禽養殖業的可持續發展提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 采樣點基本情況

采樣點位于建甌市某養豬場糞污處理沼氣工程周邊的農田（27°13.30′N；118°12.80′E），該區域屬于中亞熱帶海洋性季風氣候，四季分明，雨量充足，春夏多雨，秋冬干燥，常年平均氣溫約18.80 ℃，降雨量約1 700 mm 左右，無霜期約286 d。施肥用沼液來自該養豬場基地沼氣工程充分發酵后經氧化塘處理的液體（沼液與氧化塘的水配比為1∶2），布管道至田里，按需實施漫灌施肥。供試沼液基本理化性質為：pH 7.99，化學需氧量（COD）285 mg·L?1，五日生化需氧量（BOD5）263 mg·L?1，氨氮475 mg·L?1，總氮978 mg·L?1，總磷22.50 mg·L?1。采樣點土壤質地為砂壤土，主要種植作物為檳榔芋，每年只種1 季，3 月中下旬種植，11 月初收獲，冬季閑田。沼液灌溉的田塊按照基肥和追肥方式灌入，在檳榔芋種植前，每667 m2灌入沼液量約15 t 與田土混勻作基肥，隨后每隔15 d 進行1 次追肥，每次追肥灌入沼液量約6 t，大概8 月下旬進行最后1 次追肥，整個生長期都不施用其他肥料，其他農藝管理措施均按照當地常規習慣統一實施。

1.2 樣品的采集與制備

沼液施肥試驗開始于2013 年3 月，于2018 年10 月（沼液施肥第6 年），在檳榔芋種植地塊上進行根際土壤樣品的采集。采樣時除去表層枯枝落葉等雜物，用取土器沿著植株的根部采集0～20 cm 土層的土壤樣品，標記為BS，同時采集周邊一處地勢較高未施用沼液的檳榔芋土壤作為對照樣品，標記為CK，這2 塊檳榔芋田同屬于一個農戶，種植方式和田間管理方式相同。每塊樣地設置3 份重復，每份重復樣品均由5 點取樣法獲得5 個小樣組成，現場混合均勻后裝入無菌塑封袋中，放入帶有冰塊的保溫箱中運回實驗室。將取回的土樣分成2 份，1 份用于土壤基本理化性質的測定，另一份存放于-80 ℃冰箱內用于DNA 提取。

1.3 土壤理化性質測定

土壤pH 值采用酸度計法（土∶水=1∶2.5）測定；有機質含量采用重鉻酸鉀氧化法測定；堿解氮采用擴散法測定；速效磷采用鉬銻抗比色法測定；速效鉀采用火焰光度計法測定。每個指標都進行全程同步試劑空白控制，每個樣均設平行雙樣。

1.4 土壤基因組DNA 提取

采 用 PowerSoil DNA Isolation Kit（MoBio Laboratories, Carlsbad，CA，USA）試劑盒，參照說明書，對土壤微生物總DNA 進行提取。將提取的DNA用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，使用Nanodrop 2000 檢驗其質量和濃度。

1.5 PCR 擴增與高通量測序

選用引物ITS1-F（CTTGGTCATTTAGAGGAAG TAA）和 ITS2-R（TGCGTTCTTCATCGATGC）， 對真菌ITS 基因的ITS1 可變區進行擴增，擴增程序為：95 ℃預變性5 min，30 個循環（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），最后72 ℃延伸10 min。擴增體系總體積為20 μL，各反應組分為：4 μL 5×FastPfu Buffer 緩 沖 液，1 μL 引 物（5 μM），2 μL dNTPs（2.5 mM），2 μL 模板DNA，不足部分由無菌超純水補足。反應結束后，擴增產物通過2%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，采用QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN, Germany）凝膠回收試劑盒進行純化。將純化后的擴增片段進行文庫構建，構建好的文庫經檢測合格后，使用Illumina 公司的Miseq PE250平臺進行測序（由北京奧維森基因科技有限公司協助完成）。

1.6 數據分析

利用QIIME 1.8 軟件對測序原始數據進行質量篩查，去除barcode 和primer 并拼接后得到原始序列，經進一步去除嵌合體及短序列后得到高質量序列。使用UPARSE 10.0.240 軟件，對有效數據按97%的序列相似度進行歸并和OTU（operational taxonomic unit）劃分，統計樣品中每個OTU 的豐度信息。基于OTU 的結果，計算Chao1 指數、Observed species指數、PD whole tree 指數和Shannon 指數來進行生物多樣性分析。采用RDP Classifier（http://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/）方法對照Silva 128（http://www.arb-silva.de）數據庫對OTU 代表性序列進行物種分類注釋，比對閾值設置為70%，并在不同分類水平上統計樣本的群落組成。

樣品在不同分類水平上的群落組成比較柱形圖是通過OrginPro 2015 軟件得到的。利用R 語言的Venn Diagram 程序包和gplot 程序包分別繪制韋恩圖和熱圖，采用Canoco for Windows 4.5 軟件對真菌群落和理化因子進行典范對應分析。

2 結果與分析

2.1 長期施用沼液對土壤理化性質的影響

對檳榔芋種植地塊土壤pH 分析結果表明：連續施用沼液6 年后，土壤中pH 有降低的趨勢，但整體變化不顯著（P＞0.05），所測土樣均呈微酸性。進一步對檳榔芋地塊土壤樣本的主要化學參數分析表明：連續施用沼液6 年后，土壤有機質、堿解氮和速效鉀含量均有一定程度提高，增幅分別為4.18%、10.92%和48.95%（表1），與未施用沼液土壤相比差異均達到顯著性水平（P＜0.05）。

表 1 不同施肥方式土壤理化性質Table 1 Physicochemical characteristics of soil under varied fertilizations

2.2 長期施用沼液對土壤真菌多樣性的影響

2.2.1 土壤真菌OTU 水平分析 從未施用沼液（CK）和施用沼液（BS）兩組土壤中，分別獲得真菌總有效序列108 605 條和82 479 條，測序覆蓋率在99%以上，說明測序數據量合理，能夠比較真實的反映所測土壤樣品中真菌群落組成情況。在97%相似性水平下，對樣品的有效數據進行聚類，共劃分出2 202 個真菌OTUs。未施用沼液土壤（CK）樣品中含有真菌種類1 839 個，施用沼液土壤（BS）樣品中含有1 844 個，其中CK 和BS 有相同種類1 481 個，特有種類分別為358 個和363 個（圖1），表明不同施肥方式下土壤真菌OTUs 組成有一定的差異。

圖 1 不同施肥方式土壤真菌OTU 分布韋恩圖Fig. 1 Venn graph on fungi OTU distribution in soil under varied fertilizations

2.2.2 土壤真菌多樣性分析 基于OTU 的結果，通過Chao1、Observed species、PD whole tree 和Shannon等4 種不同的計算指標來進行樣品多樣性分析，結果如表2 所示。Chao1 指數表征微生物物種的豐富度，用以估計群落中的OTU 數目；Observed species指數用以估計樣品中實際觀測到的OTU 數目；PD whole tree 指數表征系統發育的多樣性指數；Shannon指數表征樣品中微生物群落的多樣性程度。由表2可知，與未施用沼液土壤比較，長期施用沼液土壤Chao1 和Observed species 指數顯著上升（P＜0.05），增幅分別為30.38%和26.36%，即真菌群落的物種豐富度增加；PD whole tree 和Shannon 指數也呈現上升的趨勢，其中PD whole tree 指數與未施用沼液土壤相比差異達顯著性水平（P＜0.05），即長期施用沼液后，土壤真菌群落的多樣性增加。

表 2 不同施肥方式土壤真菌多樣性分析Table 2 Fungal diversity in soil under varied fertilizations

2.2.3 土壤真菌群落組成分析 將2 組土壤樣品中得到的OTU，分別在門、綱、目、科、屬5 個水平上進行物種注釋，統計不同組土壤樣品中的真菌群落組成情況，圖2-圖4 分別展示了門、綱、屬3 個不同水平的群落結構比較結果。

圖 2 不同施肥方式土壤真菌群落在門水平的相對豐度Fig. 2 Relative abundance of fungal community at phylum level in soil under varied fertilizations

從門的分類水平上看（圖2），2 組土壤真菌主要由子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）、被孢霉門（Mortierellomycota）、未被分類的真菌門（Fungi_unidentified）、球囊菌門（Glomeromycota）、羅茲菌門（Rozellomycota）等組成，其中優勢菌門為子囊菌門、擔子菌門、被孢霉門和未被分類的真菌門，它們占整體真菌群落總豐度的92%以上。對不同施肥方式土壤中真菌類群比較發現，長期施用沼液土壤中被孢霉門的相對豐度明顯高于未施用沼液土壤，增幅為88.98%；而擔子菌門和未被分類的真菌門的相對豐度卻低于未施用沼液土壤，分別減少了13.35%和27.14%，可見施用沼液改變了土壤真菌優勢菌門的相對豐度。此外，長期施用沼液后，土壤中的一些非優勢菌門的相對豐度也發生了明顯變化，如球囊菌門和羅茲菌門所占比例呈減少趨勢，較未施用沼液土壤分別減少了88.70%和46.62%。

圖 3 不同施肥方式土壤真菌群落在綱水平的相對豐度Fig. 3 Relative abundance of fungal community at class level in soil under varied fertilizations

圖 4 不同施肥方式土壤真菌群落在屬水平聚類熱圖Fig. 4 Cluster heatmap of fungal community at genus level in soil under varied fertilizations

從綱的分類水平上看（圖3），2 組土壤真菌主要由糞殼菌綱（Sordariomycetes）、未被分類的真菌綱（Fungi unidentified）、被孢霉綱（Mortierellomycetes）、 傘 菌 綱（Agaricomycetes）、 座 囊 菌 綱（Dothidemycetes）等組成，其中優勢菌綱為糞殼菌綱、未被分類的真菌綱、被孢霉綱和傘菌綱，這些類群占整體真菌群落總豐度的67%以上。與未施用沼液土壤比較，長期施用沼液土壤中豐度顯著增加的類群為被孢霉綱，增幅為90.12%，而一些非優勢菌群如散囊菌綱（Eurotiomycetes）、球囊菌綱（Glomeromycetes）、古根菌綱（Archaeorhizomycetes）和微球黑粉菌綱（Microbotryomycetes）所占比例顯著減少，較未施用沼液土壤分別減少了47.84%、90.14%、99.29%和97.68%。

為了更形象直觀的呈現長期施用沼液后土壤真菌群落結構的變化，進一步選取相對豐度較高（＞1%）的真菌屬進行聚類分析（圖4）。

從圖4 中可以看出，2 組土壤真菌群落組成既有一定相似性，又表現出了一定差異性。未被分類的真菌屬Fungi unidentified和隸屬子囊菌門的Pseudeurotium屬聚為一類，在2 組土壤樣品中的相對豐度無明顯變化。隸屬子囊菌門的Penicillium屬、Acremonium屬和Sordaria屬、隸屬擔子菌門的Psilocybe屬、隸屬球囊菌門的Pacispora屬聚為一類，這些類群在兩組土壤中的相對豐度大小為未施用沼液＞施用沼液，為未施用沼液土壤的優勢菌屬；而隸屬子囊菌門的Rhodoveronaea屬、Trichoderma屬、Westerdykella屬和Chaetomium屬等、隸屬擔子菌門的Saitozyma屬和Ramaria屬、隸屬被孢霉門的Mortierella屬聚為一類，這些類群在長期施用沼液后比例明顯增加，成為施用沼液土壤中的優勢菌屬。

2.3 土壤真菌群落與土壤理化性質的相關性

為了分析土壤理化因子對真菌群落的影響，在門水平上選取相對豐度大于0.1%的真菌類群與土壤的pH、有機質（OM）、堿解氮（AN）、速效磷（AP）和速效鉀（AK）等5 個理化因子進行典范對應分析。首先對土壤真菌群落做降趨勢對應分析（Detrended correspondence analysis, DCA）。結果顯示，4 個排序軸中梯度最大長度為0.457，小于3，因此本研究選擇基于線性模型的冗余分析（Reundancy analysis, RDA）進行排序（圖5）。

圖 5 不同施肥方式土壤真菌冗余分析Fig. 5 Redundancy analysis on fungi in soil under varied fertilizations

從圖5 可以看出，未施用沼液和施用沼液土壤為2 個相對獨立的群落，表明它們之間的真菌群落差異較大，說明了施用沼液對土壤真菌群落的影響比較明顯。RDA 前2 個排序軸共解釋了98.0%的真菌群落變化，其中第1 排序軸解釋了84.5%的變異。經forward 分析，對真菌群落影響程度排前3 位的土壤因子依次為堿解氮、速效鉀和有機質，蒙特卡羅檢驗顯示這3 個因子對土壤真菌群落影響顯著（P＜0.05）。堿解氮、速效鉀和有機質存在明顯的協同作用，其含量與Mortierellomycota、Entorrhizomycota和Cercozoa 等菌群豐度呈極顯著或顯著正相關，而與Glomeromycota 豐度呈極顯著負相關。

3 討論

施用沼液能夠提高土壤養分含量，增加土壤中微生物的數量及多樣性指數[11]。本研究中，多樣性分析結果表明，長期沼液施肥明顯增加了土壤真菌的物種豐富度和群落多樣性。這主要是由于沼液的長期施用改善了土壤理化性質，為土壤真菌提供了良好的生長環境及充足的能源，從而刺激了真菌微生物的活性，增加其群落的豐富度和多樣性。與本研究相似，鄭學博等[6]的研究也表明沼液還田會提高土壤微生物群落功能的多樣性。左狄等[12]關于不同深度稻田土壤的研究表明，沼液還田顯著增加了各深度土壤中微生物的數量。而朱金山等[8]的研究發現，隨著沼液施肥年限的增加，稻田土壤微生物的物種豐富度和群落多樣性逐漸降低。馮丹妮等[13]關于水稻油菜輪作土壤的研究也發現，沼液連年施用不利于豐富耕層土壤細菌的群落多樣性。這可能與土壤質量狀況、不同的沼液成分或不同的澆灌措施等都有密切關系，如Jose 等[14]研究發現，土壤在受到高濃度重金屬污染后，細菌群落多樣性會顯著降低。

從群落組成上來看，本研究在2 組土壤樣品中，真菌鑒定出子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）、被孢霉門（Mortierellomycota）、球囊菌門（Glomeromycota）、羅茲菌門（Rozellomycota）等主要菌門，其中子囊菌門為兩組土壤中豐富度最高的真菌類群。與眾多研究結果一致[15?17]，子囊菌門在土壤生態系統中廣泛存在，這可能是因為子囊菌可以產生大量的無性孢子，從而快速生長[18]。另外，本研究所測土壤均呈微酸性，這也就證實了子囊菌門為酸性土壤中的主要優勢菌群[19]。同樣，2 組土壤鑒定出的優勢菌綱有糞殼菌綱（Sordariomycetes）、被孢霉綱（Mortierellomycetes）和傘菌綱（Agaricomycetes），其中豐富度最高的優勢菌為糞殼菌綱，這與徐雪雪等[20]、季凌飛等[21]的研究結果相類似，即該優勢菌普遍存在于土壤中且豐富度最高。

本研究揭示，長期施用沼液改變了土壤真菌群落的相對豐度，提高了被孢霉門的相對豐度，降低了擔子菌門、球囊菌門、羅茲菌門等的相對豐度。同樣，長期施用沼液提高了被孢霉綱的相對豐度，降低了球囊菌綱的相對豐度。大量研究表明，不同施肥模式引起土壤環境條件的改變，會間接影響土壤微生物群落結構[22?24]。在本研究中，沼液施肥后檳榔芋根際土壤的理化性質也發生了不同程度的變化。RDA 分析結果顯示，土壤堿解氮、速效鉀和有機質含量對土壤真菌群落影響顯著，之前研究也報道了這些理化因子對土壤真菌群落結構的影響。如馮翠娥等[25]的研究表明堿解氮含量是影響土壤真菌群落組成最主要的因子之一；武俊男等[26]的研究表明速效鉀含量是決定土壤真菌群落組成的關鍵因素之一；Liu 等[27]、Luo 等[28]認為有機碳含量是影響土壤真菌多樣性的重要因素。本文中，長期施用沼液明顯提高了土壤中堿解氮、速效鉀和有機質含量，這些土壤因子與被孢霉門豐度呈極顯著或顯著正相關，與球囊菌門豐度卻呈極顯著負相關，這也就導致了長期施用沼液后被孢霉門豐度增加，而球囊菌門豐度減少。另外，有研究表明，球囊菌門中分布著大量的叢枝菌根真菌，連續施用沼液可能會降低土壤中叢枝菌根真菌含量，進而降低了球囊菌門的相對豐度[29?30]。

本研究發現，與未施用沼液土壤相比，長期施用沼液后土壤真菌屬水平類群的相對豐度也發生明顯變化。其中隸屬子囊菌門的Rhodoveronaea屬、Trichoderma屬、Westerdykella屬和Chaetomium屬等、隸屬擔子菌門的Saitozyma屬和Ramaria屬、隸屬被孢霉門的Mortierella屬豐度明顯增加。這主要是因為長期的沼液施用為這些菌群的生長提供了豐富的碳源和氮源，進而促進了其生長繁殖。然而，隸屬子囊菌門的Penicillium屬、Acremonium屬和Sordaria屬、隸屬擔子菌門的Psilocybe屬、隸屬球囊菌門的Pacispora屬，這些類群在長期施用沼液后豐度明顯降低，說明這些類群對沼液施肥引發的環境變化較為敏感。另外，有研究表明，Trichoderma、Chaetomium、Penicillium、Acremonium等菌屬是目前報道的纖維素降解菌，對纖維素分解具有較強的作用[31]。本文施用沼液有效增加了Trichoderma和Chaetomium菌屬的相對豐度，說明土壤施用沼液可能有利于某些纖維素降解菌的生長，這為后續從施用沼液土壤中篩選分離能高效分解纖維素的真菌提供了基礎。然而，有關沼液施肥土壤中哪些菌為有益菌，哪些菌為有害菌，這些菌與檳榔芋生長發育之間的關系還需后期菌群功能分類分析進一步驗證。

4 結論

本文采用Illumina 平臺的MiSeq 高通量測序技術，從真菌群落多樣性、豐度及組成等方面研究了沼液施肥對檳榔芋種植地塊土壤真菌的影響。結果表明，施用沼液明顯提高了土壤有機質、堿解氮和速效鉀含量，土壤理化性質的改變影響著土壤真菌多樣性和群落結構特征。與未施用沼液土壤比較，長期施用沼液后土壤真菌物種OTUs 數量、豐富度和群落多樣性有明顯增加，不同分類水平上各真菌類群所占比例也發生了改變。真菌門水平鑒定出子囊菌 門（Ascomycota）、擔 子 菌 門（Basidiomycota）、被 孢 霉 門 （Mortierellomycota）、 球 囊 菌 門

（Glomeromycota）等類群，其中子囊菌門為土壤中豐富度最高的真菌類群。與未施用沼液土壤比較，在長期施用沼液的土壤中，被孢霉門中被孢霉綱相對豐度明顯增加，而球囊菌門中球囊菌綱豐度明顯減少；長期施用沼液后土壤真菌屬水平優勢類群也發生明顯改變。RDA 分析結果表明，施用沼液組土壤真菌群落結構與未施用沼液組差異較大，土壤堿解氮、速效鉀和有機質含量是引起土壤真菌群落變化的重要環境因素。