腫瘤炎性微環境及其對腫瘤相關巨噬細胞抑制的研究進展

劉麗榮，劉譯鴻綜述 張海波審校

19世紀中葉德國病理學家Virchow提出腫瘤起源于慢性炎性反應這一假說，并提出腫瘤的一個關鍵特征是腫瘤中存在大量的白細胞，為炎性反應在腫瘤發生過程中的重要性提供了證據。目前普遍認為慢性炎性反應可以增加罹患腫瘤的危險性，大約25%成人腫瘤由慢性炎性反應引起。因此，炎性反應被稱為“癌癥的第七大特征”。現在大量的試驗和臨床證據發現炎性反應應答和它們在腫瘤發展不同階段的作用有著重要的關系。腫瘤細胞、特異的免疫細胞各亞型、間質細胞之間動態聯系對腫瘤發展有著關鍵性作用，而以此作為腫瘤治療的靶點有著潛在的重大意義。

1 腫瘤炎性微環境

目前認為癌癥其中一個特征是伴有慢性炎性反應，而腫瘤相關的炎性反應又將促進慢性炎性組織向腫瘤組織轉化，并維持已發展腫瘤的疾病進展[1]。流行病學證據證實，由于持續感染(如乙型或丙型肝炎病毒、人類乳頭瘤病毒)或無菌炎性反應(吸煙、石棉)引起的慢性炎性狀態都與腫瘤負荷有關;相反，通過藥物抑制炎性細胞及其信號轉導通路，或通過實驗系統中的基因消融，均可降低腫瘤的發生率和進展程度[1-2]。炎性反應的主要來源是先天免疫細胞，即存在于腫瘤微環境中的巨噬細胞(tumor-associated macrophages, TAMs)，此為先天免疫細胞介導的炎性反應外在發生途徑；并且腫瘤細胞產生的細胞因子和反應性介質也是其中的主要來源，尤其是在異常遺傳所導致的原癌基因的激活或抑癌基因的失活，此為癌基因和癌細胞介導的內在途徑[1-2]。通常情況下，這2種途徑在腫瘤炎性微環境形成過程中具有明顯的共同作用。例如，共同特征是產生IL-1、TNF、IL-6類原發性炎性細胞因子，以及激活 NF-κB和STAT3 等炎性反應的主要調節轉錄因子，并產生其他介質，如細胞因子、趨化因子、生長因子和酶，通過增加腫瘤部位白細胞的募集進一步刺激炎性反應。因此，當炎性反應級聯激活時，會建立一個前饋回路，其中產生可導致組織損傷的反應因子，同時刺激組織再生。此外，持續暴露于活性氧和活性氮(ROS、RNS)可誘導惡性細胞的表觀遺傳改變、抑制DNA修復機制、積累DNA 突變，最終有利于轉化細胞的增殖潛能[3-4]。

腫瘤微環境是一個復雜的、動態的和失調的部位，即使是免疫細胞、成纖維細胞、內皮細胞等正常細胞也會受到腫瘤細胞及其分泌物的嚴重影響。在腫瘤組織中，結締組織支架結構、細胞外基質成分和蛋白水解酶與正常組織相差很大，越來越多研究提示它們是腫瘤進展和轉移的主要參與者，以及與免疫細胞一起構建炎性反應微環境[5-6]。

腫瘤微環境中炎性反應信號的持續激活是隨著組織穩態和結構破壞的侵襲進展而產生的。正常細胞和腫瘤細胞來源的細胞應激分子、凋亡或壞死物質的釋放代表了引發巨噬細胞刺激和M2 極化的另一個因素，用于組織修復激活和成纖維細胞募集[7-9]。慢性炎性反應與葡萄糖濃度、缺氧、iNOS、趨化因子(例如CCL2)和TGFβ的改變，協同成纖維細胞募集和纖維化過程激活，這是一種常見的病理生理變化[10-11]。這些變化也可以在腫瘤微環境及其組織重構的漸進結構中發現，遵循偽傷口愈合程序[12-13]。

組織的硬化有助于改變上皮細胞行為，誘導上皮細胞向間質的轉變，并通過與整合素的相互作用，刺激促進細胞運動的細胞骨架變化。 即使是ECM儲存的TGFβ 也可以被釋放，與M2樣TAMs合作進一步促進免疫抑制微環境和腫瘤相關成纖維細胞(CAF)促纖維化激活[14]。

腫瘤病灶中的免疫細胞來源于血液循環。在新發展的腫瘤中，單核細胞第一個到達并且分化成腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)，通常構成最豐富的免疫群體。其中T細胞為主的適應性免疫細胞也被分化形成。具有抗腫瘤細胞毒性的活化T細胞會普遍存在于表達免疫系統“可見”抗原肽的免疫原性腫瘤中，最終破壞腫瘤細胞或限制其進展侵襲。然而更常見的情況是，已成型的腫瘤會強制反抗，抑制環境中的抗腫瘤反應[15]。巨噬細胞在適當刺激時原則上會具有細胞毒性，受腫瘤細胞的強烈調節，分化和功能極化為具有腫瘤營養功能的免疫抑制效應物，維持其進展并抑制適應性免疫應答[15]。事實上，強有力的證據強調了腫瘤中高TAMs數量或巨噬細胞相關基因特征與更具侵襲性的疾病和患者預后不良之間的相關性[16 -22]。

2 腫瘤微環境中的炎性因子

隨著越來越多關于腫瘤微環境中復雜的炎性反應回路網絡的研究，為靶向腫瘤所致炎性反應的新治療模式奠定了更深厚的基礎。長期使用非甾體抗炎藥(NSAID)預防心血管事件的人群比例越來越高，為開展癌癥發病率和病死率的流行病學研究提供了機會。在大量的人群研究中發現，阿司匹林的日常使用顯著降低了腫瘤發病風險，尤其是結直腸癌；并且在已經發病的腫瘤患者中發現，其能有效地提高患者5年生存率。薈萃分析研究也發現其他腺癌的風險降低，例如受體陽性乳腺癌[23-25]。NSAID抑制COX-2 酶的活性并減少前列腺素的合成。前列腺素是一類脂質介質，參與包括炎性反應等多種不同反應，在腫瘤環境中可能維持腫瘤細胞的存活和血管生成[26]。其他消炎藥，如對乙酰氨基酚和布洛芬，可能也具有類似的預防潛力，但這些藥物被較低比例的受試者使用，而且通常使用時間較短，因此目前暫無對大量人群的觀察研究。

炎性細胞因子和趨化因子是炎性反應的關鍵介質，并且存在于腫瘤微環境中，其中它們由腫瘤細胞和基質細胞，尤其是巨噬細胞產生。主要介質是腫瘤壞死因子(TNF)、白細胞介素-6(IL-6)和白細胞介素-1(IL-1)，它們會導致不同細胞因子和趨化因子的釋放，從而增強炎性反應，并在局部生產部位募集新的免疫細胞。如上所述，這些細胞因子通常通過刺激其增殖或存活及局部組織的侵襲能力，或通過刺激新血管生成的過程來加速腫瘤進展[2,21]。

依據這些理論基礎，針對性地抑制炎性細胞因子是合理的，而且臨床前研究也證實，在不同的小鼠腫瘤模型中，針對腫瘤所致炎性反應策略有潛在療效。然而，目前臨床研究證據相當有限[27]。在腫瘤學中，抗TNF 單克隆抗體被用于不同類型的癌癥治療，盡管有部分腎細胞癌患者存在一定反應[28]，但能維持疾病穩定(SD)的患者比例很小。卵巢癌患者體內能檢測到IL-6的抗體，并且部分患者伴有SD[29]。總體而言，這種療法療效未能達到期望，可能需要聯合常規化療或其他靶向治療。

3 TAMs在腫瘤發生中的作用

TAMs影響腫瘤細胞行為的不同方面。 在機制上，腫瘤中的巨噬細胞和相關骨髓細胞產生生長因子，如表皮生長因子(EGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、血管內皮生長因子(VEGF)，這些生長因子直接支持腫瘤細胞在非最佳條件下的增殖和存活[30-31]。TAMs 能維持腫瘤的生長，其機制通常是產生能夠調節特定基因、激活細胞凋亡和增殖途徑的細胞因子。例如，IL-6 激活 STAT3，后者通過作用于不同因子(cyclin D、Bcl-XL、Bcl-2 和 Mcl-1)，達到控制細胞存活[32]。

在腫瘤生長的缺氧微環境中，巨噬細胞在缺氧區域積聚并分泌許多促血管生成因子，包括 VEGF、CXCL8、胎盤生長因子(PlGF)和前動力蛋白(Bv8)[33]。TAMs 還產生幾種蛋白水解酶和參與細胞外基質重塑的其他介質，例如基質金屬蛋白酶 (MMPs)和組織蛋白酶。TAMs對細胞外基質的降解有利于腫瘤細胞的局部侵襲，滲透到血管內并分散轉移[34]。其他由腫瘤巨噬細胞產生的細胞因子，如IL10和TGFβ，具有強烈的免疫抑制作用，并抑制T淋巴細胞的抗腫瘤細胞毒性[35-36]。同時，TGFβ能維持 M2樣TAMs，刺激成纖維細胞生成和沉積膠原。產生的纖維化可能是常規細胞運輸的進一步障礙，同時也限制了氧和藥物滲透到腫瘤組織中，因此針對抑制TGFβ治療的研究正在開展[37]。

淋巴管生成在腫瘤淋巴轉移中起著重要作用。目前TAMs 產生的VEGF-C 和VEGF-D 被認為在誘導淋巴管生成中起著關鍵作用。在膽囊癌模型中，Yang 等[38]發現TAMs 通過表達VEGF-C和VEGF-D 誘導淋巴管生成和腫瘤淋巴管轉移；使用可溶性的VEGFR-3 阻斷VEGF-C/D，以及使用氯磷酸鹽脂質體清除TAMs，能明顯減緩上述進程。

腫瘤上皮間質轉化(EMT)是極化的上皮細胞轉變成間充質樣細胞的過程。在轉換過程中，細胞表面上皮標志物如E-鈣黏蛋白、橋粒斑蛋白等表達下調，而間質標志物如N-鈣黏蛋白、波形蛋白等表達上調，使其喪失了細胞間的黏附力和頂端—基部的極性，促進腫瘤的進展和轉移。TAMs表達的TGF-β1 能激活TGF-β 信號通路，依靠Smad 依賴性或Smad 非依賴性2種信號途徑誘導EMT。TGF-β1 分泌后可通過自分泌的方式發揮作用，激活TGF-β 通路，形成正反饋，維持正在進行EMT 轉化的腫瘤細胞的間充質特性。TAMs來源的IL-6借助TGF-β 通路參與EMT，IL-8 則通過Jak2/STAT3/Snail信號通路促進EMT[39-40]。

TAMs 還可以表達 PD-1的配體PD-L1，這種途徑是抑制免疫系統適應性的最重要途徑之一[41]。此外，TAMs通過形成淋巴細胞浸潤的成分發揮其抑制作用：它們產生趨化因子(例如 CCL17，CCL22)，其募集調節性T細胞和Th2淋巴細胞，導致對腫瘤細胞失去細胞毒性能力，并負性影響Th-1 介導的反應。

4 抑制TAMs的相關治療

使用免疫檢查點抑制劑的免疫治療現在已成為越來越多腫瘤患者的既定治療方法。臨床研究已經驗證有效的靶點包括細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4(CTLA-4)、PD-1和PD-L1[42]。浸潤腫瘤微環境的巨噬細胞可以表達PD-1配體(PD-L1和PD-L2)，以及 CTLA-4 配體(B7-1和B7-2)[43-44]。因此，抗檢查點阻斷的免疫療法也可能影響巨噬細胞，無論是通過直接抑制配體分子，或通過激活抗體依賴性細胞毒性(antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC)殺傷CTLA-4陽性和PD-1陽性的T淋巴細胞。在臨床前模型中，表達FcγR的巨噬細胞對于清除腫瘤中CTLA-4和抗體包被的T 細胞至關重要[45]。

動物模型和臨床試驗顯示針對TAM的治療,包括清除TAM、TAM的再極化及提高TAM的抗原遞呈功能等手段,不僅具有單獨的抗腫瘤作用,而且還和免疫檢查點等免疫治療手段具有良好的協同作用。腫瘤細胞糖酵解和缺氧是抗腫瘤治療失敗的主要因素,TAM清除劑和免疫檢查點抗體聯用可以增強免疫檢查點抗體的抗腫瘤效率。Jeong 等[46]在非小細胞肺癌的研究中表明,TAM 可以分泌TNF-α 促進腫瘤細胞的糖酵解,而TAM 中增加的AMP 活化蛋白激酶(AMP-activatedprotein kinase,AMPK)和過氧化物酶體增殖激活受體γ共激活因子1-α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha,PPARGC1α)會導致腫瘤缺氧。應用氯磷酸鹽清除TAM能夠消除腫瘤的有氧糖酵解和使缺氧、需氧的腫瘤細胞表達PD-L1顯著增加、腫瘤中T 細胞浸潤增加,從而使原本對PD-L1 抗體不反應的非小細胞肺癌患者產生了明顯的抗腫瘤反應。

ADCC長期以來被認為是巨噬細胞和NK細胞介導殺死腫瘤細胞的重要機制。來自臨床前模型和臨床相關證據的發現表明，ADCC是治療腫瘤用的單克隆抗體有效性的重要組成部分，包括那些針對CD20、HER2和EGFR的單克隆抗體[47]。對接受治療患者的FcγR基因研究發現了與抗體具有高親和力結合的多態性。這些基因型的表達與淋巴瘤患者對利妥昔單抗(抗CD20抗體)、結直腸癌患者對西妥昔單抗(抗EGFR抗體)和乳腺癌患者對曲妥珠單抗(抗HER2抗體)的治療應答增強相關[44]。這表明TAMs在單克隆抗體的臨床治療中起著重要作用。

多形性膠質母細胞瘤(glioblastoma multiforme,GBM)是一種致命的高度侵襲性惡性腦腫瘤,目前已發現TAM 和小膠質細胞是腫瘤微環境中促進腫瘤的主要細胞,阻斷SIRPα-CD47信號能夠誘導TAM 和小膠質細胞對腫瘤細胞的吞噬作用,此方法對包括GBM 在內的各種腦腫瘤有效[48]。

5 展望

腫瘤的持續治療不僅需要針對增殖的腫瘤細胞，還需要針對整個腫瘤微環境。由于有充分證據證明慢性炎性反應會促進腫瘤進展并抑制免疫抗腫瘤反應，因此腫瘤所致炎性反應是需要針對的目標。一些抑制炎性細胞因子或設計用于靶向腫瘤中巨噬細胞的藥物制劑已經在實驗中顯示出一定效果，其中TAMs通過VEGF-A在腫瘤血管、淋巴管及EMT進程的各個階段發揮著作用，已成為抗腫瘤靶向藥物研究的重要靶標。這些藥物的早期臨床試驗結果表明，一些患者確實獲得了顯著的臨床效益，能保證一定的疾病穩定(SD)和較長的無進展生存期(PFS)，藥物不良反應適中且可控。這些結果相當重要，為聯合化療或其他療法奠定基礎。