菊粉對小鼠抗疲勞作用及對腸道微生物的影響

向岑，趙玙璠，榮耀，陳開陽，遲明，郁彭，滕玉鷗，，*

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457；2.青海省輕工業(yè)研究所有限責(zé)任公司，青海西寧810008）

菊粉，俗稱菊糖，主要存在于植物中，如菊科、桔梗科、龍膽科、百合科、禾本科的菊芋、菊苣、大理菊、薊、大蒜、蘆筍塊莖等[1]，共計36 000多種，分布范圍較廣，產(chǎn)量較高，該類植物成為中國境內(nèi)菊粉的主要來源[2]。菊粉作為一種富含低聚果糖的水溶性膳食纖維，相關(guān)研究已經(jīng)證實其具有多種多樣的生理學(xué)功能[3]，例如降血脂[4]、降血糖[5]、促進(jìn)礦物質(zhì)吸收[6]、調(diào)節(jié)腸道微生物菌群[7]、抗抑郁[8]等。目前，菊粉多用來作為一種食品功能性基料，生產(chǎn)低聚果糖、果糖漿或結(jié)晶果糖等，并成功應(yīng)用在保健食品、飲料、乳制品及醫(yī)藥化工領(lǐng)域，具有很好的開發(fā)前景[9]。

疲勞是一種主觀不適應(yīng)的感覺反饋，其最初的定義為細(xì)胞中毒造成的一定損傷，隨后經(jīng)過幾次不同的概念推演，于1982年將疲勞定義為機(jī)體在其生理過程中不能維持其機(jī)能在特定水平上和（或）不能維持預(yù)定的運動強(qiáng)度的現(xiàn)象[10]。該現(xiàn)象對機(jī)體造成的危害相當(dāng)嚴(yán)重，如若不及時消除或緩解該癥狀的出現(xiàn)，不但會影響工作事務(wù)的推進(jìn)，嚴(yán)重者更會直接危害人類生命健康。腸道菌群與人類的健康息息相關(guān)[11]，腸道菌群失調(diào)會導(dǎo)致多種疾病，例如非酒精性脂肪肝炎[12]、炎癥性腸病[13]、肥胖[14]、阿爾茲海默癥[15]等。近年來有研究表明，疲勞綜合征往往伴隨著腸道菌群紊亂[16]。另外鼠模型的最新證據(jù)表明，運動期間的身體和情緒壓力與胃腸道微生物群組成的變化之間存在高度相關(guān)性[17]。

對抗疲勞方向的物質(zhì)的開發(fā)，目前主要有人參皂苷[18]、蝦青素[19]、荔枝多糖[20]和鐵皮石斛[21]等，它們都顯示出了良好的抗疲勞作用活性，而且主要成分都含有多糖。菊粉也是一類多糖物質(zhì)[22]，但是菊粉的研究目前基本集中在菊粉酶等相關(guān)領(lǐng)域，對菊粉抗疲勞特性研究很少。本文研究菊粉對小鼠抗疲勞作用及調(diào)節(jié)腸道菌群作用，為菊粉相關(guān)功能性食品應(yīng)用與開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

含不同劑量菊粉的小鼠日糧型鼠糧：青海省輕工業(yè)研究所有限責(zé)任公司；SPF級昆明雌性小鼠[6周齡，體重（20±2）g，合格證號 SCXK（京）2016-0006]：北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

磷酸肌酸激酶（creatine kinase，CK）試劑盒、血乳酸（blood lactic acid，BLA）試劑盒、血尿氮素（blood urea nitrogen，BUN）試劑盒：南京建成生物工程研究所有限公司；QIAamp DNA糞便迷你試劑盒：Qiagen公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SYNERGY H1型多功能酶標(biāo)儀：美國Biotek公司；MB100-4A型微板恒溫振蕩孵育器：杭州奧盛（All Sheng）儀器有限公司；D-3750型離心機(jī)：美國SIGMA公司；MS 3 B S25x型渦旋振蕩器：德國IKA公司；ME204型電子天平：美國Mettler Toledo公司；PCR儀：美國Bio-Rad公司；DYCP-31BN型瓊脂糖水平電泳儀：北京六一公司；Miseq測序平臺：美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組及給藥劑量

將120只健康雌性昆明小鼠隨機(jī)分為空白對照組（普通日糧型鼠糧）、低劑量組（含5%菊粉日糧型鼠糧）、中劑量組（含10%菊粉日糧型鼠糧）、高劑量組（含20%菊粉日糧型鼠糧），共4個處理組，每組30只。飼養(yǎng)溫度為（25±2）℃，濕度50%～60%。連續(xù)喂養(yǎng)120 d，飼養(yǎng)期間小鼠自由攝食和飲水。

1.3.2 力竭游泳實驗

小鼠喂養(yǎng)至第120天，小鼠稱量體重，之后每組隨機(jī)取10只，末次解藥0.5 h之后，按孫靖輝等[23]所述方法，將小鼠放入水深30 cm，水溫保持（25±0.5）℃的游泳箱（65 cm×45 cm×40 cm）中游泳，并在每只小鼠尾部附著質(zhì)量為其體重5%的鉛皮，從小鼠入水開始計時，直至小鼠體力耗盡及小鼠頭部入水10 s內(nèi)不能浮出水面。記錄每組小鼠力竭游泳的時間。

1.3.3 血清中BUN含量及CK活力測試

小鼠喂養(yǎng)至第120天，小鼠稱量體重，之后每組隨機(jī)取10只，末次解藥0.5 h之后，按照趙小寧[24]所采用的方法，將小鼠放在溫度為30℃的水中游泳90 min，并撈出進(jìn)行摘眼球取血處理，將血液收集于2 mL離心管中，室溫（25℃左右）靜置2 h，3 500 r/min離心10 min，收集上清液，放于-20℃下儲存?zhèn)溆谩K活力和BUN含量測試按試劑盒說明進(jìn)行，結(jié)果用SYNERGY H1型多功能酶標(biāo)儀分別在660 nm與640 nm下測試。

1.3.4 BLA含量測定

小鼠喂養(yǎng)至第120天，小鼠稱量體重，之后每組隨機(jī)取10只，末次解藥0.5 h之后，按照劉秀英等[25]所述的方法，將小鼠置于溫度為（30±1）℃的游泳箱中游泳60 min后停止，待小鼠恢復(fù)15 min后摘眼球采血，收集血液于2mL離心管中，取50μL全血并加入300 μL蛋白沉淀劑（取自BLA試劑盒），混勻后以3 500 r/min速度離心10 min，取上清液，-20℃儲存?zhèn)溆茫糜贐LA含量測定。BLA含量測定按試劑盒說明進(jìn)行，結(jié)果用SYNERGY H1型多功能酶標(biāo)儀分別在530 nm下進(jìn)行測試。

1.3.5 腸道菌群分析

1.3.5.1 糞便標(biāo)本收集

第120天收集一次糞便標(biāo)本至1.5 mL無菌2 mL離心管中，每份約200 mg，隨后立即液氮速凍并置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5.2 樣品處理及測序

采用試劑盒QIAamp DNA糞便迷你試劑盒提取小鼠糞便標(biāo)本中的基因組DNA，對16S rRNA的V3-V4區(qū)域進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增并純化，建庫完成后使用Agilent 2100 Bioanalyzer對文庫的片段范圍及濃度進(jìn)行檢測。檢測合格的文庫根據(jù)插入片段大小，選擇HiSeq平臺進(jìn)行測序。

1.3.5.3 生物信息學(xué)分析

測序所獲得數(shù)據(jù)經(jīng)過濾，通過reads之間的overlap關(guān)系將reads拼接成Tags；將Tags聚類成操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）并與數(shù)據(jù)庫比對、物種注釋；基于OTU和注釋結(jié)果進(jìn)行樣品物種復(fù)雜度分析，組間物種差異分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 不同劑量菊粉對小鼠負(fù)重游泳能力的影響

菊粉劑量對小鼠負(fù)重游泳時間的影響見圖1。

圖1 菊粉劑量對小鼠負(fù)重游泳時間的影響Fig.1 Effect of inulin dose on weight-bearing swimming time

小鼠游泳時間長短代表著機(jī)體抗疲勞能力的強(qiáng)弱[26]。由圖1可知，添加不同劑量菊粉喂養(yǎng)小鼠120 d后，服用菊粉組小鼠均顯著高于空白對照組，說明添加菊粉喂養(yǎng)小鼠可以顯著延長小鼠的游泳時間，提升機(jī)體的抗疲勞能力。其中，中劑量組較低劑量組提升0.9倍，增強(qiáng)幅度大于高劑量組與中劑量組的差異，表明隨著劑量的增加，小鼠的游泳時間增長速率減緩。

2.2 不同劑量菊粉對CK的影響

菊粉劑量對CK活性的影響見圖2。

圖2 菊粉劑量對肌酸激酶活性的影響Fig.2 Effect of inulin dose on serum creatine kinase activity

CK作為機(jī)體磷酸原供能系統(tǒng)代謝的關(guān)鍵酶之一，不論低或者高強(qiáng)度的運動都會造成其含量的增高，因此血清中CK活性是評定機(jī)體訓(xùn)練負(fù)荷的代表性指標(biāo)[27]。由圖2可知，不同處理組小鼠經(jīng)過相同的運動負(fù)荷后，CK活性由大到小依次為空白對照組>低劑量組>中劑量組>高劑量組；并且空白對照組與其他處理組均成顯著性差異（p<0.05），處理組整體呈現(xiàn)出明顯的抑制效果，說明菊粉對小鼠運動后的CK活性的升高具有顯著的抑制作用。3個劑量組之間隨著劑量的升高，CK活性逐漸下降，且中劑量組與低、高劑量組沒有明顯差異（p>0.05）。

2.3 不同劑量菊粉對小鼠BLA含量的影響

菊粉劑量對小鼠血乳酸含量的影響見圖3。

圖3 菊粉劑量對小鼠血乳酸含量的影響Fig.3 Effect of inulin dose on blood lactic acid content in blood

BLA是糖代謝的中間產(chǎn)物，其濃度的高低間接反映著組織供氧、供血情況和糖代謝等指標(biāo)。在動物正常的生理過程中，丙酮酸通過乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）作用不斷地產(chǎn)生BLA，直至BLA產(chǎn)生速率大于其去除速率，濃度得以增加。由圖3可知，小鼠劇烈游泳后，BLA的濃度隨著菊粉劑量的增大而降低，說明菊粉對小鼠運動后的BLA濃度的上升具有抑制作用；并且中、高劑量均對其抑制作用達(dá)顯著性水平（p<0.05），而低劑量處理組效果不顯著（p>0.05），表明BLA濃度對菊粉劑量呈現(xiàn)一定的劑量依賴性（p<0.05）。

2.4 不同劑量菊粉對小鼠血漿中BUN含量的影響

菊粉劑量對小鼠運動后BUN的影響見圖4。

圖4 菊粉劑量對小鼠運動后BUN的影響Fig.4 Effect of inulin dose on BUN after exercise

正常情況下，BUN在機(jī)體始終保持著動態(tài)平衡的狀態(tài)，當(dāng)機(jī)體進(jìn)行激烈的運動時會增加體內(nèi)蛋白質(zhì)的分解程度，導(dǎo)致血中BUN含量會升高，因此機(jī)體內(nèi)BUN含量是衡量機(jī)體運動負(fù)荷的主要指標(biāo)[28-29]。由圖4可知，空白組、低劑量組、中劑量組和高劑量組的BUN含量分別為 15.10、14.11、13.51、11.97 mmol/L。其中，中、高劑量組與空白對照組相比分別下降10%（p<0.05）和21%（p<0.05）水平，說明中高劑量菊粉可以顯著抑制劇烈運動導(dǎo)致的BUN含量升高。

2.5 不同劑量菊粉對小鼠腸道菌群的影響

菊粉劑量對小鼠腸道菌群相對豐度的影響見圖5。

圖5 菊粉劑量對小鼠腸道菌群相對豐度的影響Fig.5 Effect of inulin dose on relative abundance of intestinal flora in mice

菊粉在調(diào)節(jié)腸道菌群、改善腸道功能方面有重要作用[30]。不過，不同國家對菊粉的攝入量標(biāo)準(zhǔn)并不統(tǒng)一，并且最新的研究報道指出，高劑量菊粉的攝入可能會引發(fā)因菌群失調(diào)導(dǎo)致的肝病風(fēng)險[31-32]，因此菊粉的攝入量需要嚴(yán)格的規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)[33]。由圖5可知，隨著菊粉攝入劑量的加大，擬桿菌科、雙歧桿菌科在菌群中的比例顯著升高，而乳酸菌含量有所降低。此外，其中值得注意的是高劑量菊粉飼養(yǎng)下的小鼠腸道內(nèi)擬桿菌科、腸桿菌科出現(xiàn)大量增殖，導(dǎo)致對個體潛在危害的發(fā)生，而中劑量下腸道菌群保持著對個體最佳的物種多樣性。

3 結(jié)論

本研究通過負(fù)重游泳實驗、劇烈運動后疲勞相關(guān)生化指標(biāo)測試以及腸道菌群豐度測試研究了菊粉的抗疲勞作用及調(diào)節(jié)腸道菌群作用。得出結(jié)論如下：菊粉能夠使小鼠增強(qiáng)耐力，降低疲勞相關(guān)生化指標(biāo)CK活性、BUN和BLA含量。同時，菊粉也表現(xiàn)出了可以調(diào)節(jié)腸道菌群豐度的活性，但是高劑量菊粉進(jìn)食會導(dǎo)致菌群失調(diào)及有害菌的增長。綜上所述，菊粉可能具有抗疲勞和調(diào)節(jié)腸道菌群豐度的作用且服用劑量不宜太高。