響應面優化核桃分心木多酚超聲輔助提取工藝

劉靜，黃慧福，劉繼華 ，葉朋飛

（1.曲靖職業技術學院，云南曲靖655011；2.曲靖師范學院，云南曲靖655011）

核桃，又名胡桃、羌桃，隸屬于胡桃科，與腰果、扁桃、榛子齊名，并稱為世界“四大干果”，主要分布在我國云南、陜西、新疆等地，是一種具有很高經濟效益和社會效益的珍貴果木[1-4]。云南自然條件優越，為核桃生長提供了優厚的地理條件，其中90%以上的縣種植核桃，種植面積、產量均居中國首位。

核桃分心木，簡稱分心木，別名隔心木，為胡桃科植物胡桃果核內的木質隔膜[5-7]。木質隔膜呈薄片狀、多彎曲、破碎而不整齊，表面呈淡棕色至棕褐色，或棕黑色，略有光澤，質脆、易折斷、氣微、味微苦，以塊大、質薄、色黃為佳。分心木為核桃主要副產物之一，約占核桃總質量的4%～5%[8-9]，可入藥，具有利尿清熱、健脾固腎等功效。研究表明，分心木富含多酚[10]、多糖[11]、黃酮[12]等生物活性成分，可用于化妝品、藥品等中。植物多酚又名植物單寧，為植物體內的復雜酚類次生代謝物，具有多元酚結構，具有天然性和光譜抑菌性[13-15]，在食品、藥品、化妝品等行業具有廣闊的應用前景。目前對植物多酚的研究較多，但對核桃分心木多酚的研究較少，因此該領域極具研究價值。超聲波法是提取天然產物活性成分的一種有效手段，具有耗時短、成本低、且較傳統提取方法產量高等優點[16-17]。本試驗以核桃分心木為材料，探究料液比、乙醇體積分數、超聲時間、超聲溫度對多酚提取率的影響，旨在為分心木的進一步開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

核桃：保山市蒲縹鎮；沒食子酸標準品（純度≥98%）：天津市光復精細化工研究所；石油醚（分析純）、無水乙醇（分析純）：天津市風船化學試劑科技有限公司；無水碳酸鈉（分析純）：北京試劑有限公司；福林酚：北京索萊寶科技有限公司。

UV5100型可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；SB-3200DT超聲波清洗器：上海科導超聲儀器有限公司；TDL5A離心機：上海安亭科學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分心木多酚提取工藝

分心木干燥后，用粉碎機粉碎，過60目篩，待用。準確稱取1.000 0 g分心木粉末，按照一定的料液比加入不同濃度的乙醇，在一定溫度下的超聲波清洗器中提取一定的時間。提取結束后，減壓抽濾，收集濾液，采用Folin-Ciocateu[18-19]法測定提取液中多酚的含量。

1.2.2 多酚得率的計算

1.2.2.1 標準曲線的建立

精確配制1 mg/mL的沒食子酸標準品母液，依次配制質量濃度為 0.01、0.03、0.05、0.07、0.09 mg/mL 的沒食子酸標準溶液。精密吸取不同濃度的沒食子酸標準品溶液1 mL，置于10 mL的試管中，加入0.1 mg/mL福林酚試劑5 mL，充分振搖，靜置2 min，再加入4 mL 7.5%Na2CO3溶液，置于陰暗處靜置反應60 min，以蒸餾水做空白對照，于760 nm波長處測其吸光度[20-21]。以沒食子酸濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線，并計算標準曲線方程。

1.2.2.2 多酚提取率的計算

式中：C為提取液中多酚的質量濃度，mg/mL；V1為樣品提取液定容總體積，mL；V2為量取提取液樣品測定定容的體積，mL；V3為測定用樣液體積，mL；M為樣品質量，g。

1.2.3 單因素試驗

1.2.3.1 料液比對提取率的影響

準確稱取1.000 0 g分心木粉末，固定乙醇體積分數為60%、超聲溫度為60℃、超聲時間為40 min，選取料液比為 1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1∶60、1∶70（g/mL）。考察料液比對分心木多酚提取率的影響。

1.2.3.2 乙醇體積分數對提取率的影響

準確稱取1.000 0 g分心木粉末，固定料液比為1 ∶60（g/mL）、超聲溫度為 60℃、超聲時間為 40 min，選取乙醇體積分數為40%、50%、60%、70%、80%。考察乙醇體積分數對分心木多酚提取率的影響。

1.2.3.3 超聲時間對提取率的影響

準確稱取1.000 0 g分心木粉末，固定料液比為1∶60（g/mL）、乙醇體積分數為50%、超聲溫度為60 ℃，選取超聲時間為 20、30、40、50、60 min。考察超聲時間對分心木多酚提取率的影響。

1.2.3.4 超聲溫度對提取率的影響

準確稱取1.000 0 g分心木粉末，固定料液比為1∶60（g/mL）、乙醇體積分數為50%、超聲時間為50 min，選取超聲溫度為 40、50、60、70、80 ℃。考察超聲溫度對分心木多酚提取率的影響。

1.2.4 響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，以分心木多酚提取率為響應值，根據Box-Behnken中心組合設計原理，選取料液比（A）、乙醇體積分數（B）、超聲時間（C）、超聲溫度（D）為自變量，對核桃分心木多酚的提取工藝進行優化[22-23]，如表1所示。

表1 響應面試驗因素與水平表Table 1 Factors and levels table of response surface design

1.3 數據處理

所有數據均平行做3次，結果取算術平均值。運用統計軟件Origin8.5、Design Expert8.0進行數據的處理和分析。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的確定

根據測定的沒食子酸標準品溶液在各個濃度下的吸光度值，計算得回歸方程為：y=0.009 5x+0.011 7，R2=0.999 2，線性關系良好。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 最佳料液比的確定

料液比對多酚提取率的影響見圖1。

圖1 料液比對多酚提取率的影響Fig.1 The effect of material liquid ratio on extraction rate of polyphenols

由圖1可知，多酚提取率隨著料液比的減小呈上升的趨勢，這是因為隨著溶劑的增加多酚的溶解度增加。當料液比為1∶60（g/mL）時，提取率達到最高，隨后下降，分析原因可能是溶劑過多，非多酚物質溶出導致提取率下降[24]。考慮成本等因素，確定料液比為1 ∶60（g/mL）最優。

2.2.2 最佳乙醇體積分數的確定

乙醇體積分數對多酚提取率的影響見圖2。

圖2 乙醇體積分數對多酚提取率的影響Fig.2 The effect of ethanol concentration on extraction rate of polyphenols

由圖2可知，隨著乙醇體積分數增加，多酚提取呈現先升高后下降的趨勢，在乙醇體積分數為50%時，多酚得率達到最大。造成這種現象的原因可能是：乙醇體積分數太高時，分心木提取液中的醇溶性雜質會溶出，影響多酚在乙醇溶液中的溶解，所以綜上所述，選擇乙醇體積分數為50%最優。

2.2.3 最佳超聲時間的確定

超聲時間對多酚提取率的影響見圖3。

圖3 超聲時間對多酚提取率的影響Fig.3 The effect of ultrasonic time on extraction rate of polyphenols

從圖3可知，隨著提取時間延長，多酚提取率呈現先升高后下降的趨勢，當提取時間為50 min的時候，多酚提取率達到最大。分析可能有以下原因[25]：一是分心木細胞結構被破壞，胞內的其他成分溶出；二是提取時間過長導致多酚的機構被破壞。因此超聲提取時間選擇50 min。

2.2.4 最佳超聲溫度的確定

超聲溫度對多酚提取率的影響見圖4。

圖4 超聲溫度對多酚提取率的影響Fig.4 The effect of ultrasonic temperature on extraction rate of polyphenols

由圖4可知，隨著超聲提取溫度的升高，提取率逐漸提高，當超聲提取溫度為70℃時，多酚提取率最高，隨后下降，可能是由于溫度過高，多酚的結構被破壞。所以超聲溫度選擇為70℃。

2.3 響應面試驗結果及分析

2.3.1 響應面試驗結果

以核桃分心木多酚提取率（Y）為響應值，根據Box-Behnken試驗設計原理，選擇料液比（A）、乙醇體積分數（B）、超聲時間（C）、超聲溫度（D）為影響因素得出試驗結果如表2。

表2 響應面試驗結果Table 2 The results of response surface test

對表2中的各組數據進行多項擬合回歸分析，得擬合方程為：Y＝6.99+0.18A-0.096B+0.067C+0.27D+0.052AB-0.014AC+0.012AD+0.084BC+0.18BD-6.625×10-3CD-0.26A2-0.30B2-0.42C2-0.77D2。

2.3.2 方差分析

以A、B、C、D為自變量，以分心木多酚提取率Y為響應變化值，運用Design-Expert8.0對試驗結果進行方差分析，方差分析結果如表3所示。

從表3可知，模型的P值達到了極顯著水平；失擬項P＝0.1171>0.05，不顯著，說明模型擬合度較好。決定系數R2adj為0.989 1，說明該模型能解釋98.91%響應值的變化，因此可用該模型來分析和預測分心木中多酚的提取。根據F值的大小得出各因素對響應值影響順序為：D>A>B>C。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

2.3.3 各因素間交互作用分析

通過Design Expert8.0軟件可以做出響應面曲線圖，分析超聲提取溫度、料液比、超聲提取時間、乙醇體積分數4個因素的交互作用對分心木多酚提取率的影響，結果見圖5～圖10。

圖5 料液比和乙醇體積分數的響應曲面和等高線Fig.5 The response surface and contour figure about material liquid ratio and ethanol concentration

圖6 料液比和超聲時間的響應曲面和等高線Fig.6 The response surface and contour figure about material liquid ratio and ultrasonic time

圖7 料液比和超聲溫度的響應曲面和等高線Fig.7 The response surface and contour figure about material liquid ratio and ultrasonic temperature

圖8 乙醇體積分數和超聲時間的響應曲面和等高線Fig.8 The response surface and contour figure about ethanol concentration and ultrasonic time

圖9 乙醇體積分數和超聲溫度的響應曲面和等高線Fig.9 The response surface and contour figure about ethanol concentration and ultrasonic temperature

圖10 超聲時間和超聲溫度的響應曲面和等高線Fig.10 The response surface and contour figure about ultrasonic time and ultrasonic temperature

從響應面3D圖的坡度陡峭程度和等高線橢圓形狀可以看出四因素之間交互作用的強弱，響應面3D圖的坡度越平緩，說明因素對響應值的影響不大，相反，響應面3D圖的坡度越陡峭，說明素對響應值的影響較大；等高線呈圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓則與之相反。

從圖5～圖10可知料液比與乙醇體積分數、乙醇體積分數與超聲時間、乙醇體積分數與超聲溫度的等高線趨于橢圓，說明它們之間的交互作用明顯；料液比與超聲時間、料液比與超聲溫度、超聲時間與超聲溫度的等高線趨于圓形，說明它們之間的交互作用不明顯。

2.4 最佳工藝及驗證試驗

根據響應面回歸模型方程分析，得出最優提取條件為：料液比1∶61.74（g/mL）、乙醇體積分數49.65%、超聲時間50.34 min、超聲溫度70.83℃、提取率為7.04%。根據實際情況，將提取條件修正為：料液比1 ∶62（g/mL）、乙醇體積分數 50%、超聲時間 50 min、超聲溫度71℃，并進行3次試驗，結果取平均值為6.98%，實際所測的平均值和預測值相差-0.01%，表明試驗結果與模型符合較好，可靠性較高。

3 結論

通過單因素試驗分析料液比、乙醇體積分數、超聲時間、超聲溫度對多酚提取率的影響，結合響應面法優化超聲輔助提取核桃分心木多酚提取的最佳條件。結果表明，最佳提取工藝參數為：料液比1∶62（g/mL）、乙醇體積分數50%、超聲時間50 min、超聲溫度71℃，多酚提取率6.98%。