蝦類肝腸胞蟲流行病學研究進展

胡吉卉，李正民，段健誠，高煥，2

（1. 江蘇海洋大學海洋科學與水產學院，江蘇省海洋生物技術重點實驗室；江蘇 連云港 222005；2. 江蘇省農業種質資源保護與利用平臺，江蘇 南京 210014）

蝦肝腸胞蟲（Enterocytozoon hepatopenaei, EHP）隸屬于微孢子蟲科（Microsporidia）、腸胞蟲屬（Enterocytozoon），成熟的孢子大小為（0.9±0.3）μm×（1.8±0.3）μm，呈橢圓形[1－2]。2003 年在泰國養殖的斑節對蝦（Penaeus monodon）中發現，2009 年被成功分離，并被定義為孢子蟲屬的一個新物種[3]。

肝腸胞蟲作為一種專性細胞內寄生蟲，主要寄生在蝦類肝胰腺肝小管上皮細胞內，且具有高度傳染性。凡納濱對蝦（P. vannamei）、脊尾白蝦（Palaemon carincauda）和斑節對蝦（P. monodon）等主要經濟養殖蝦類都是其主要感染對象，感染后會造成蝦類生長緩慢或停滯，是影響全球蝦類養殖生產的重要病原之一[4－5]。該文總結了國內外現有的研究成果，重點介紹了肝腸胞蟲在流行情況、病理癥狀、致病機理、傳播途徑、檢測方法和防治措施等方面的研究進展，以期為肝腸胞蟲的病害防治提供指導幫助。

1 流行情況

自2003 年被發現以來，中國、印度、委內瑞拉、馬來西亞、印度尼西亞等多個國家都有EHP 檢出的相關報道[6]。從2013 年開始，我國多個省市的蝦類養殖基地先后發現了EHP 感染，并且感染率呈上漲趨勢。2015 年上半年，浙江省水產技術推廣站檢測了70 多個苗種場的134 份南美白對蝦蝦苗樣品，結果發現EHP 的檢出率達53.8%[7]；同年5—9 月，舟山地區270 份凡納濱對蝦樣本中，EHP 的檢出率高達85.19%[8]。2015—2017 年天津市蝦肝腸胞蟲的流行情況調查顯示，當地養殖蝦類中存在不同程度的EHP 感染，2015 年和2016 年EHP 的檢出率分別為56.96%、69.52%[9]。2019 年江蘇省溫室池塘養殖蝦類中EHP 的患病率為56.3%，而土塘養殖蝦類中EHP 的患病率則達到了79.5%[10]。由此可見，EHP 引發的感染病已經嚴重危害了我國蝦類養殖業。

2 病理癥狀

EHP 會使養殖蝦類感染肝胰腺微孢子蟲病（Hepatopancreatic microsporidiosis, HPM），感染后沒有明顯的臨床癥狀，攝食正常，腸道飽滿，沒有大批量死亡。2～3 個月后病蝦表現為生長速度緩慢甚至停止生長，體型大小差異明顯，約50%左右的染病蝦體質量增長到4～5 g 時再無變化。嚴重感染時，病蝦腸道出現發炎，解剖發現其肝胰腺萎縮病變、發軟、顏色變深，少數病蝦還會出現白便癥狀[11]。

取感染蝦的血淋巴進行檢測，發現其總蛋白量和白蛋白量顯著上升，堿性磷酸酶（alkalinephos phatase, ALP）、谷草轉氨酶（asparate transaminase,AST）和谷丙轉氨酶（alanine transaminase, ALT）等肝損傷指標數值顯著高于健康蝦[12]。由此可知EHP會引起肝胰腺病變，從而導致肝胰腺功能受損。

3 感染機制

EHP 無法在細胞外進行繁殖，只能寄生在細胞內部，因此其感染方式也比較獨特。目前普遍認為極管是EHP 感染宿主細胞的主要細胞器[13]。極管是以螺旋形盤繞在孢子內部的一種管狀結構，由極管蛋白組成且具有彈性。當孢子進入宿主體內時，由于外界環境的刺激，孢子內部壓力急劇增大，極管外翻并彈出，刺破宿主細胞膜，然后將孢原質注射進宿主細胞內部[14]。孢原質在新的細胞中增殖循環，最終產生新的孢子，從而實現孢子的繁殖和遺傳物質的復制[15]。

4 傳播途徑

傳播是寄生蟲感染宿主群體并完成生活史的重要環節之一。EHP 的傳播有兩種途徑：水平傳播和垂直傳播。

4.1 水平傳播

大多數微孢子蟲都具有致病性，且大多通過水平傳播方式感染脊椎和無脊椎宿主[16]。EHP 的水平傳播途徑相對復雜，既可以通過攝食傳播，即健康蝦攝食被EHP 污染的飼料或餌料、病死蝦殘體以及養殖水環境中的孢子體而被感染[17]；也可以通過養殖水體傳播，即健康蝦生活在含有EHP 孢子的養殖水體中被感染[18]。

4.2 垂直傳播

垂直傳播是指EHP 通過母體宿主傳遞到子代宿主，通過宿主的繁殖實現自身傳播。2018 年Vukhac等[19]給親蝦投喂已感染的蝦組織，在無節幼體中發現了EHP 的感染，第一次證明EHP 可以在凡納濱蝦類中垂直傳播，并根據這個結果建立了一種針對蝦類幼體EHP 檢測的PCR 方法。

5 檢測方法

EHP 的檢測有多種方法，顯微鏡技術、細胞培養方法、動物模型等方法都可檢測到[20]。但由于EHP個體微小，光學顯微鏡觀察蟲體形態的方法很難直接判斷，因此常采用組織學或分子生物學方法來對EHP 進行確切的診斷。

5.1 組織學方法

病理檢測是目前臨床醫學最為可靠的一種定性診斷，可通過組織石蠟切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，顯微觀察，最終發現組織病理變化，準確判斷病因[21]。目前常用的組織染色法有HE 染色法、甲苯胺藍（TB）染色法、Masson 染色法、普魯士藍（PB）染色法、愛顯藍-雪夫（AB-PAS）染色法、偉郝夫范吉森（EVG）染色法、勞克堅牢藍（LFB）染色法和天狼猩紅（Sirius red）染色等[1]。常曉晴等[21]對以上8 種染色方法進行比較，綜合分析染色效果及檢出率，發現Masson 染色法效果最佳。然而，組織學方法檢驗耗時長，制作流程繁瑣，且肝腸胞蟲含量低時極易漏診，因此，現在主要將其用作臨床診斷的輔助工具。

5.2 分子生物學方法

與組織學方法相比，分子生物學方法更靈敏、更快速、特異性更強，是目前實驗室檢測EHP 最常使用的技術手段。目前常用的分子生物學方法主要有普通PCR 檢測法、環介導等溫擴增技術（Loopmediated isothermal amplification, LAMP）、地高辛標記核酸探針原位雜交法、巢式PCR、實時熒光定量PCR 法等，這些方法在快捷程度和靈敏度上各有優劣。

5.2.1 環介導等溫擴增技術 環介導等溫擴增技術是一種新型核酸擴增技術，具有特異性強、敏感性高、成本低廉的優點。因其操作簡單、檢測速度快，常用于現場的快速檢測。孫妍等[22]比較了LAMP方法和常規PCR 方法在檢測EHP 靈敏度方面的差異，發現該方法檢出限為3.71 個質粒拷貝/μL，靈敏度是普通PCR 的100 倍。

5.2.2 原位雜交技術（ISH） ISH 是一種比PCR 法靈敏度更高，且可以定位和相對定量檢測EHP 的方法。該方法利用核酸分子單鏈之間互補的堿基序列，將探針與待測DNA 或RNA 結合成專一的核酸雜交分子，經一定手段將其顯現出來[23]。Tang 等[24]采用該方法特異性的檢出了凡納濱對蝦組織、糞便和養殖水體中存在的EHP。不足的是該方法操作繁瑣且費時。

5.2.3 PCR 檢測法 普通PCR 方法只進行一次特異性片段的擴增，容易出現假陽性，因此很難準確的判斷EHP 感染[25]。巢式PCR 作為一種變異的聚合酶鏈反應，通過兩輪PCR 反應，增強了檢測的特異性和敏感度。Amornrat 等[17]擴增了EHP SSU rDNA 基因并且構建了系統進化樹，建立了EHP 的一種巢式PCR 檢測方法，證明了EHP 不是凡納濱對蝦白便綜合征的原因。Jaroenlak 等[25]針對EHP 的胞外蛋白基因進行了鑒定和基因組測序，并以此建立了一種新的巢式PCR 檢測方法，即靈敏度更高的SWP-PCR 法。

實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）是利用熒光信號的積累實時監測PCR 進程，然后對未知模板進行定量分析的檢測方法。目前已建立的實時熒光定量PCR 方法根據使用所使用的熒光物質不同分為TaqMan 探針法和SYBR Green I 熒光染料法兩種，更常用的是操作簡單且成本低的SYBR Green I 熒光染料法。駱云慧等[26]建立了靈敏度比常規PCR 高10 倍的TaqMan 實時熒光定量PCR 檢測方法，該方法對EHP 標準質粒的檢測靈敏度為5.2×102copies/μL，可滿足高通量檢測。劉珍等[5]優化了熒光定量PCR 反應條件，建立了檢測靈敏度比普通巢式PCR 高約4 倍的SYBR Green I 實時熒光定量PCR 檢測方法。該方法簡單快速且靈敏度高，避免了因樣品的代表性和靈敏度而造成的誤診問題。

6 防治措施

EHP 的出現，嚴重危害著蝦類養殖，國內外學者也對其防治措施進行了大量的研究。但由于EHP的嚴格細胞寄生，其成熟的孢子壁有一層極堅硬的幾丁質外殼，外源性藥物很難見效，目前還未發現有效的治療藥物[27]。因此對于EHP 的防治應“防重于治，防治結合”雙管齊下，根據實際情況，對養殖過程中的每一個可能感染EHP 的環節做好風險防控，多方面實施預防手段，進而減少EHP 的感染。

6.1 嚴格的清塘處理

有機質豐富的池塘會給EHP 的中間宿主提供適宜的生存環境，因此在放苗前，要對池塘進行徹底的清塘處理，尤其是曾經感染過EHP 的養殖池溏。處理方式包括對池塘底泥進行翻耕，并用氫氧化鈉、生石灰等強堿性物質對塘底消毒，從而破壞大部分微孢子蟲適宜的生存環境，排除蝦EHP 存在的隱患[20]。

6.2 育苗生物安全

選擇優質的蝦苗進行繁殖和培育，繁殖前要進行嚴格且正規的檢測。培育親蝦的培育池及日常養殖使用的工具，在正式使用之前要確保清潔干凈。做好池塘的清淤消毒，之后還要進行干燥處理。以上措施雖不能完全消滅EHP，但可以降低EHP 的數量水平。

6.3 加強池塘管理

池塘水質的穩定對于蝦類的養殖尤為重要，因此要對池塘進行嚴格的管理。應主要從以下幾個方面加強管理：①要及時撈出病蝦、死蝦，防止健康蝦殘食；②及時清理蝦的排泄物和代謝產物，避免污染水質，導致進一步的交叉污染；③可以在飼料中添加一些保肝護腸道的產品，改善蝦的體質，防止寄生蟲感染腸道；④蝦類養殖用水在使用前，需經過蓄水池沉淀、砂濾、曝氣、消毒等處理；養殖過程中產生的廢水，必須要經過科學處理后，排放到指定的地點，防止擴大污染；⑤要根據實際養殖情況對池塘定期換水，必要時可向池中添加一些水質凈化劑[28]。⑥降低池水鹽度一定程度上可預防蝦EHP的傳播。

7 展望

蝦類養殖集約化是未來發展大勢所趨，但高密度養殖卻加快了疾病的流行和傳播。目前EHP 對我國蝦類養殖已造成了不可估量的危害，但其生活史、與宿主之間的聯系以及孢子萌發機制等問題都沒有得到完全的解決。因此，在未來的研究工作中，應加強蝦類養殖環境的保護與治理，加快優質蝦類苗種的繁育工作，改進EHP 檢測和預防技術，并盡快研制治療EHP 的有效藥物，以保障蝦類養殖的健康發展。