新型冠狀病毒(COVID-19)精準(zhǔn)藥物設(shè)計(jì)
——基于病毒感染人體細(xì)胞進(jìn)程的初步探討

王敬章，張瑞英，白 凈，張玉華，張向陽(yáng)，劉 睿

(1. 河北工程大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，河北 邯鄲 056038；2. 河北工程大學(xué) 附屬醫(yī)院，河北 邯鄲056002；3. 河北工程大學(xué) 圖書館，河北 邯鄲 056038)

在過(guò)去20年間，冠狀病毒SARS和MERS引起的非典型肺炎和中東呼吸綜合征給人們健康帶來(lái)了嚴(yán)重威脅。2020年初春，一場(chǎng)突如其來(lái)的新型冠狀病毒肺炎疫情席卷而來(lái)，直接影響人民生命安全和身體健康。2020年2月11日，世衛(wèi)組織將之命名為Corona Virus Disease 2019，簡(jiǎn)稱COVID-19。簡(jiǎn)言之，COVID-19是新型冠狀病毒，可引起患者嚴(yán)重呼吸障礙，并導(dǎo)致多臟器衰竭甚至死亡[1]。目前，學(xué)術(shù)界對(duì)于COVID-19的研究十分匱乏，尚無(wú)療效確切的精準(zhǔn)治療藥物。

筆者近幾年來(lái)進(jìn)行過(guò)一些病毒學(xué)研究[2-3]，認(rèn)識(shí)到病毒入侵人體過(guò)程的一些相似之處。本文將依據(jù)病毒感染細(xì)胞的一般過(guò)程，淺析COVID-19精準(zhǔn)藥物設(shè)計(jì)的主要技術(shù)思路。

1 COVID-19精準(zhǔn)藥物設(shè)計(jì)的基本前提

目前對(duì)于COVID-19的研究，至少三個(gè)方面取得重要成果：第一，在流行病學(xué)方面，認(rèn)識(shí)到COVID-19引起的典型臨床癥狀包括發(fā)燒、干咳、呼吸困難、頭痛、肺炎等，肺泡損傷可導(dǎo)致呼吸衰竭甚至死亡，并逐步闡明COVID-19的流行趨勢(shì)、人際傳播規(guī)律、傳播途徑等[1, 4-7]；第二，在病毒形態(tài)方面，獲取了COVID-19高清電子顯微圖片，確認(rèn)其冠狀病毒特性，認(rèn)識(shí)了COVID-19與以往病毒的相似和差別之處[6-7]；第三，在病毒基因分析方面，利用pan-CoV聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和基因測(cè)序技術(shù)準(zhǔn)確識(shí)別了COVID-19的“核酸序列”(GISAID編號(hào)EPI_ISL_402124)，并開(kāi)發(fā)出基于spike基因受體結(jié)合域的qPCR檢測(cè)方法[4, 7-9]。

不過(guò)，上述成果的臨床應(yīng)用一般局限于檢測(cè)COVID-19病毒和確診患者，并不能直接作為治療手段殺滅病毒或治療患者。在此基礎(chǔ)上，新的COVID-19治療藥物可以嘗試抑制“病毒核酸序列”的最終產(chǎn)物——即病毒的各種蛋白質(zhì)，未來(lái)此類抑制COVID-19特定蛋白質(zhì)的藥物可統(tǒng)稱為COVID-19精準(zhǔn)治療藥物。

2 以“病毒感染細(xì)胞進(jìn)程”為線索的COVID-19精準(zhǔn)藥物設(shè)計(jì)思路

鑒于COVID-19與SARS-CoV、MERS-CoV、HIV-1等病毒的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及感染過(guò)程類似之處，本文參照相關(guān)抗病毒藥物的研究，為基于細(xì)胞感染進(jìn)程的COVID-19精準(zhǔn)治療藥物設(shè)計(jì)提供一些研究思路，聚焦細(xì)胞受體結(jié)合、細(xì)胞入侵、病毒脫殼、RNA轉(zhuǎn)錄或逆轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯、新病毒組裝等關(guān)鍵環(huán)節(jié)，研判COVID-19精準(zhǔn)藥物的設(shè)計(jì)方向。

2.1 開(kāi)發(fā)適合COVID-19的廣譜抗病毒藥物

廣譜抗病毒藥物意指該藥物可對(duì)多種現(xiàn)有病毒和新病毒起到抑制效果[10-11]。然而，病毒結(jié)構(gòu)過(guò)于簡(jiǎn)單，僅具有核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)的核心結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)外殼結(jié)構(gòu)，因此病毒本身可供攻擊的靶點(diǎn)分子非常少，這給抗病毒藥物研發(fā)造成了困難。再者，病毒的基因序列變異性強(qiáng)，導(dǎo)致各種病毒結(jié)構(gòu)功能差異較大，因此很難獲得對(duì)抗所有病毒的藥物分子。

目前較公認(rèn)的廣譜抗病毒藥如利巴韋林、干擾素等，具有阻礙病毒核酸和蛋白合成、抑制病毒生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)人體免疫力等作用，它們能否對(duì)COVID-19起到抑制效果需要詳細(xì)的臨床療效確認(rèn)。最近，一些基于Benzoxazine、Labyrinthopeptin、DABMA以及天然產(chǎn)物的小分子化合物顯示出較強(qiáng)的廣泛抗病毒活性，期待它們能成為抗COVID-19精準(zhǔn)藥物的候選分子[10-13]。另外，必須充分認(rèn)識(shí)COVID-19與其它病毒結(jié)構(gòu)、功能的相似之處，才可能開(kāi)發(fā)出某些新的廣譜抗病毒藥物，并取得較好的臨床治療效果。

2.2 COVID-19弱毒株制備疫苗——預(yù)防病毒入侵人體

疫苗在全面防控COVID-19疫情過(guò)程中將起到重要作用。典型的疫苗制備原理是將減毒處理的病毒部分成分注射于人體，使人體獲得免疫記憶，增強(qiáng)未來(lái)對(duì)病毒的免疫識(shí)別力。目前COVID-19疫苗正在研發(fā)中，多家單位已獲得毒性較弱COVID-19病毒，但疫苗研發(fā)需要病毒滅活處理、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、人體測(cè)試、申報(bào)審批等多個(gè)環(huán)節(jié)，一般需要幾年時(shí)間才能完成。目前疫情急需的情況下，有望大大加快審批和生產(chǎn)步伐。據(jù)了解，李蘭娟院士、陳薇院士等研究團(tuán)隊(duì)制備若干適合做疫苗的COVID-19毒株或腺病毒載體疫苗，國(guó)外科研院所也投入巨資推動(dòng)COVID-19疫苗研發(fā)，多個(gè)國(guó)家、地區(qū)和企業(yè)的通力合作有望大力推動(dòng)COVID-19的疫苗研發(fā)進(jìn)程。

2.3 COVID-19痊愈患者的血清抗體——早期疫苗替代物

接種疫苗的主要目的是為了讓人產(chǎn)生針對(duì)COVID-19的血清“中和抗體”，在人體遇到病毒時(shí)起免疫防御作用。為了快速緩解當(dāng)前治療壓力，臨床正在嘗試?yán)肅OVID-19患者康復(fù)后捐獻(xiàn)的血漿制備成抗病毒生物制品，其中包含大量的COVID-19中和抗體，注射到重癥患者體內(nèi)可誘導(dǎo)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，加快病毒清除速度，其臨床療效理論上與注射疫苗后所產(chǎn)生抗體效力相當(dāng)，目前正在做初步臨床觀察。在療效更加確切的精準(zhǔn)藥物獲批之前，痊愈患者的血清抗體將為危重患者提供新的治愈希望。

2.4 靶向COVID-19表面蛋白的單克隆抗體——特異阻斷病毒進(jìn)入人體細(xì)胞

通過(guò)對(duì)比冠狀病毒分類的7個(gè)保守復(fù)制酶結(jié)構(gòu)域，COVID-19與SARS-CoV有較高的相似度，意味著二者在毒性機(jī)理和預(yù)防治療方面存在共通之處[7, 14]。經(jīng)過(guò)對(duì)COVID-19的保守蛋白序列分析表明，COVID-19屬于嚴(yán)重急性呼吸綜合征相關(guān)的冠狀病毒(SARSr-CoV)，并與SARS-CoV一樣均利用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶ACE2受體進(jìn)入人體細(xì)胞[7]。一個(gè)關(guān)鍵之處在于，冠狀病毒表面的Spike蛋白可與人體細(xì)胞受體ACE2結(jié)合，在病毒識(shí)別并吸附人體細(xì)胞表面、穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞的過(guò)程中起重要作用，因此Spike蛋白經(jīng)常成為抗病毒藥物研發(fā)的靶標(biāo)分子[4, 8, 14-16]。預(yù)測(cè)利用免疫學(xué)技術(shù)設(shè)計(jì)針對(duì)COVID-19表面分子如Spike蛋白的中和抗體，或者利用基因工程、蛋白質(zhì)工程技術(shù)生產(chǎn)適合的ACE2片段多肽，有可能特異結(jié)合Spike等蛋白并封閉其與細(xì)胞受體結(jié)合活性，阻斷它們通過(guò)ACE2受體感染人體細(xì)胞的入侵途徑，從而降低COVID-19病毒的人群傳播[5, 8, 14, 17]。在這些情況下，即使少量COVID-19病毒進(jìn)入人類呼吸道，但由于病毒表面分子已經(jīng)被抗體藥物阻遏，就無(wú)法再結(jié)合人體細(xì)胞表面受體，也就不能進(jìn)入人體細(xì)胞，那么病毒無(wú)法實(shí)現(xiàn)自我復(fù)制、滯留于細(xì)胞外、逐漸喪失活性乃至最終死亡。

2.5 COVID-19核酸聚合酶抑制劑——阻斷病毒核酸在人體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制

除Spike蛋白外，RNA依賴性RNA聚合酶(RdRp，RNA-dependent RNA polymerase)是另一個(gè)可能具有抗冠狀病毒效果的目標(biāo)分子[5, 17]。在COVID-19的全長(zhǎng)基因組序列中，存在編碼RdRp的基因序列區(qū)，它在病毒核酸復(fù)制及病毒繁殖過(guò)程中起關(guān)鍵作用，因此RdRp屬于一種潛在的抗病毒藥物針對(duì)的關(guān)鍵酶[5, 7, 17]。COVID-19等病毒感染人體細(xì)胞后，必須經(jīng)過(guò)病毒脫殼、核酸釋放、核酸合成等步驟，才能增加病毒核酸的數(shù)量，完成病毒復(fù)制的基礎(chǔ)準(zhǔn)備工作。在此過(guò)程中，首先需要聚合酶RdRp按照病毒的核酸序列進(jìn)行新的RNA合成，這對(duì)于COVID-19的早期蛋白生產(chǎn)、結(jié)構(gòu)蛋白成熟、子代病毒組裝都至關(guān)重要[5, 7, 17]。因此，參照以往病毒抑制相關(guān)研究[18-19]，COVID-19的RdRp酶抑制劑可能是精準(zhǔn)治療藥物的一個(gè)重要方向，通過(guò)抑制RdRp活性可阻止病毒核酸復(fù)制，缺少核酸作為模板時(shí)，下游蛋白質(zhì)合成就會(huì)終止，病毒生長(zhǎng)繁殖就會(huì)被顯著抑制。

2.6 COVID-19反義核酸鏈(RNAi技術(shù))——阻斷病毒蛋白質(zhì)(或多肽鏈)合成

COVID-19病毒核酸RNA是指導(dǎo)其蛋白質(zhì)大量合成的必需模板，可以嘗試通過(guò)RNAi技術(shù)抑制病毒RNA的功能。反義核酸鏈(miRNA或siRNA)是一類短小的人工合成RNA片段，它們是按照病毒自身RNA序列特別設(shè)計(jì)的，可以與特異的病毒RNA結(jié)合形成互補(bǔ)雙鏈；由于病毒蛋白質(zhì)合成需要單鏈的RNA模板，因此與miRNA或siRNA形成雙鏈的病毒RNA就會(huì)喪失指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的功能，缺少蛋白質(zhì)來(lái)源的病毒即無(wú)法持續(xù)存活或擴(kuò)增[20-21]。未來(lái)可以嘗試針對(duì)COVID-19的關(guān)鍵基因如Spike、RdRp、3CL水解酶、E基因等設(shè)計(jì)精確的抑制性RNAi片段，阻斷COVID-19關(guān)鍵基因的功能和關(guān)鍵蛋白質(zhì)的合成，起到必要的抗病毒療效。

2.7 COVID-19關(guān)鍵水解酶的抑制劑——阻斷病毒蛋白成熟、新病毒顆粒組裝

病毒核酸片段很短，其合成的較長(zhǎng)多肽鏈往往需要經(jīng)過(guò)蛋白酶的水解，才能產(chǎn)生具有活性和功能的多種蛋白質(zhì)。冠狀病毒3CL水解酶(Mpro)又稱主蛋白酶，是病毒蛋白水解并成熟所必需的一種催化酶[5, 22-23]。COVID-19疫情發(fā)生后，上海科技大學(xué)饒子和、楊海濤團(tuán)隊(duì)僅用一周時(shí)間就測(cè)定出COVID-19最重要的3CL水解酶(Mpro)的高分辨率晶體結(jié)構(gòu)，并登錄在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)(Protein Data Bank，PDB，編號(hào)6LU7)。這項(xiàng)工作使科學(xué)界進(jìn)一步認(rèn)清COVID-19病毒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，未來(lái)可以嘗試充分利用生物信息學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、基因技術(shù)、蛋白質(zhì)工程等設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)多肽類或小分子化合物，特異抑制COVID-19的3CL水解酶活性，這樣便可阻止病毒蛋白的裂解和成熟，使得COVID-19大量蛋白質(zhì)處于無(wú)活性、無(wú)功能的原始狀態(tài)，從而阻止新病毒顆粒的組裝、成熟和細(xì)胞外釋放，減緩或阻止COVID-19感染在人體內(nèi)細(xì)胞和組織間的傳播。

3 結(jié)論

通過(guò)設(shè)計(jì)小分子化合物、多肽片段、抗體或反義RNA鏈等，可能阻斷COVID-19感染人體細(xì)胞基本過(guò)程的一個(gè)或幾個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，有望達(dá)到精準(zhǔn)防治COVID-19病毒的目的，為徹底戰(zhàn)勝該新型冠狀病毒奠定一些臨床基礎(chǔ)。