高通量測序在肝硬化患者腹水、血清及糞便微生物群檢測中的應用

李 真， 張 維， 賈 琳， 胡中杰

首都醫科大學附屬北京佑安醫院 肝病重癥醫學科， 北京 100071

二代測序，又稱高通量測序，是對一個物種的幾十萬到幾百萬DNA分子基因組和轉錄組同時進行測序，經生物信息學分析鑒定出標本中所含核酸的種類, 并可獲得該物種的序列數、覆蓋度等定量分析數據，從而全面分析該物種。二代測序具有檢測速度快、準確率高、成本低、覆蓋面廣以及產出巨大等特點[1]。目前，二代測序在醫學方面已經運用于腫瘤、寄生蟲病、遺傳病、基因水平檢測等多種疾病的檢測、預防及治療[1]，該技術也有助于肝硬化患者并發感染的診治，值得進一步關注。

臨床上，肝硬化患者極易發生細菌感染，感染發生率是一般人群的4～5倍[2]，尤其是住院患者，其細菌感染發生率高達25%～40%[3]，臨床以自發性細菌性腹膜炎(spontaneous bacterial peritonitis，SBP)最為多見[4]。感染是肝硬化患者常見的并發癥及常見死亡原因之一[5]。肝硬化患者感染癥狀隱匿，對于懷疑感染者必須盡早進行病原學檢查，以便獲得藥敏結果以指導臨床治療，降低病死率。SBP的診斷和治療是臨床實踐中的難點，因此需引入新的診療體系。值得關注的是，人體腸道微生物群構成了一個穩態平衡、共生生態系統[6]。雖然已有研究[7]發現人類疾病與腸道微生物的多樣性、數量以及豐度分布相關，但其因果關系尚不明確，需要更深入的研究。亦有研究[8]表明，肝硬化的發展可能與腸道微生物群結構變化有關。現就二代測序在肝硬化方面的應用綜述如下。

1 二代測序在肝硬化腹水微生物群的應用

目前，臨床上常規應用腹水細菌培養方法獲得SBP致病菌，但細菌培養耗時長，且因大量腹水的稀釋以及預防性廣譜抗生素的應用，導致腹水培養陽性率為10%～60%[9]。此外，細菌培養技術無法檢測出苛養菌、胞內菌、病毒等病原體[10]。二代測序技術的出現為腹水病原學診斷提供了一種更為精準的方法[1,11]。2015年，Feng等[12]通過二代測序技術和16sPCR方法，對有或無SBP的肝硬化腹水患者進行腹水菌群鑒定，發現在同一個標本中二代測序對于細菌DNA分子更敏感，即使是低豐度細菌也能夠識別。在這些檢測標本中，大腸桿菌占所有檢測細菌豐度的一半以上，革蘭陽性菌感染呈上升趨勢。該研究表明，二代測序技術是鑒定肝硬化腹水或其他低豐度細菌DNA標本微生物學的有力方法。此外，Engelmann等[3]收集173例失代償期肝硬化患者的腹水樣本，采用定量PCR及二代測序(Ripseq測序平臺)對細菌DNA陽性的腹水樣本進行測序，發現白細胞性腹水和非白細胞性腹水檢測出細菌DNA的概率相近(40% vs 43.5%)，且腹水細菌DNA水平>520 拷貝/ml患者的30、180 d存活率大大降低；而腹水細菌DNA水平>5000 拷貝/ml的患者預后最差。上述研究表明，患者的生存率與腹水細菌DNA水平顯著相關。同時，進一步通過Ripseq測序平臺對細菌DNA陽性腹水樣本測序，發現腹水細菌譜主要是革蘭陽性菌株[13]，該研究結果與近年來腹水細菌DNA的檢測結果是一致的，即83.8%的檢測細菌是革蘭陽性菌[14]。這些實驗數據提示，近年來革蘭陽性腹水感染逐漸在增加。因此，近年來有學者建議將細菌DNA檢測作為細菌易位的標志。通過二代測序技術檢測腹水中的細菌DNA，發現腹水中的細菌不僅僅可以來自腸道，也可來自皮膚定植菌[15]，或者菌血癥患者血液中的細菌[16]。Rogers等[15]選取25例肝硬化腹水的患者，通過實時定量PCR方法對腹水標本中總細菌載量進行定量，并進一步應用焦磷酸測序技術鑒定細菌種類和相對豐度，發現腹水標本中除了腸道相關的菌群，還有其他許多非腸道微生物，如機會性感染相關的需氧菌屬，包括不動桿菌、假單胞菌、拉爾斯頓菌、寡養單胞菌和葡萄球菌；也有來自于皮膚定植菌，如丙酸桿菌屬。由此可見，治療SBP患者選擇抗生素時具有一定困難，一般抗生素不可能覆蓋如此廣泛的微生物種類。因此，利用二代測序技術更加準確快速檢測腹水主要致病菌，指導臨床抗生素治療，對提高患者生存率至關重要。

2 二代測序在肝硬化血清微生物群的應用

既往研究多應用傳統的PCR技術檢測肝硬化患者血標本中的微生物，但是檢測率低，且檢測到的大多數細菌十分單一，多為大腸桿菌或金黃色葡萄球菌[17]。Santiago等[18]通過二代測序技術對7例健康對照者與27例肝硬化患者的血清微生物標本組進行測序，同時也對比分析11例肝硬化腹水患者的腹水和血清微生物標本，發現在肝硬化患者的血清和腹水中均能檢測到復雜且特異的微生物群落，以厚壁菌和擬桿菌最豐富，而健康對照組的血清標本中幾乎檢測不到。與不伴有腹水的肝硬化患者相比，肝硬化腹水患者血清中以梭菌屬最具有多樣性，且相對豐度較高，通過β-多樣性分析發現血清和腹水標本中微生物組成相似。同樣，該研究表明，相較于無腹水的患者，肝硬化腹水患者的炎癥狀態明顯增加。有趣的是，Caro等[19]通過對77例肝硬化腹水患者的血清和腹水標本進行細菌DNA測序，鑒定細菌種類，發現細菌易位的細菌類型(革蘭陰性或革蘭陽性細菌)對于炎癥反應影響程度不同，當其血清和腹水中存在革蘭陰性菌DNA時，炎癥因子TNFα、IFNγ和NO濃度較高；且TNFα水平與細菌DNA濃度和脂多糖(LPS)呈顯著相關。而NO濃度與細菌DNA濃度顯著相關，但與LPS水平無關；INFγ和IL-12的水平與細菌DNA和LPS水平均無顯著相關性。結果表明，血漿中的細菌DNA濃度是與炎癥反應最準確相關的因素。因此，對肝硬化感染高風險患者使用諾氟沙星初步預防，不僅可以顯著降低SBP的發生率，也可降低肝腎綜合征的發生率[16]。此外，肝硬化患者若存在菌血癥，微生物可以通過非細菌易位途徑，轉移至腹腔，從而導致SBP的發生。有研究[15]在有寵物接觸史的SBP患者腹水中發現有巴氏菌、蠟樣芽孢桿菌，表明肝硬化患者若存在菌血癥，也可能導致腹水感染。

綜上所述，通過二代測序技術系統分析肝硬化并發SBP患者血液的微生物組學特征，同時引入同源性分析，從宏基因組學方面深入探究細菌易位的方式，有助于闡明SBP的發生機制。同時，通過表征SBP微生物組學特征，有助于指導臨床抗菌藥物的選擇和精準抗感染治療。

3 二代測序在肝硬化糞便微生物群的應用

肝硬化患者若合并門靜脈高壓癥，因膽汁酸分泌減少、門靜脈高壓、腸黏膜屏障受損，腸道黏膜上皮通透性增加[20]，影響腸道微生物群的組成和生長。腸道微生態失調與肝硬化的發病機制及終末期肝病的發生發展存在因果關系[21]。大多數腸道細菌無法直接培養，難以對其進行全面分析。二代測序技術解決了這一難題，使得對微生物的多樣性分辨及物種的定性、定量分析成為可能[22]。更多的二代測序實驗結果顯示，肝硬化患者的腸道微生物群發生變化，對肝臟有益的微生物群相對減少，但致病類微生物群(如葡萄球菌科、腸桿菌科和腸球菌科)相對過度生長[23]，表明腸道微生物菌群的變化是肝硬化患者病情進展程度相關的獨立因子[24]。Chen等[25]收集36例肝硬化患者和24例健康人群的糞便微生物標本，對16S核糖體RNA V3區域采用454焦磷酸測序，分析糞便微生物群，發現肝硬化患者的糞便微生物群落潛在致病細菌(如腸桿菌科、鏈球菌科)增多，有益細菌(如雙歧桿菌、毛螺菌)減少；Child-Turcotte-Pugh評分與鏈球菌科呈正相關，與螺菌科呈負相關，提示腸道微生物群的改變可能影響肝硬化患者的預后。該研究結論也被其他團隊的研究驗證，如Qin等[26]通過定量宏基因組學分析了肝硬化患者的腸道微生物群，表明肝硬化的發展可能與腸道微生物群結構變化有關；Wei等[27]采用高通量Solexa測序分析糞便中微生物群落和功能，發現腸道菌群的改變與疾病的嚴重程度呈正相關[28]。Santiago等[18]采用16S核糖體DNA高通量測序對27例肝硬化患者與17例健康對照人群的糞便微生物組進行比較，發現健康人群的糞便微生物群落較肝硬化患者具有更高的多樣性，提出血清和糞便微生物組成的改變可作為肝硬化進展的指標。Rogers等[14]對25例肝硬化腹水患者，通過焦磷酸測序技術鑒定細菌種類及相對豐度，發現在肝硬化患者的腸道菌群中，以變形菌門最多(53.9%)，其次是厚壁菌門(21.2%)、放線菌門(17.4%)和擬桿菌門(4.4%)。而健康個體的腸道菌群以擬桿菌門和厚壁菌門為主，肝硬化患者的腸道菌群中，擬桿菌門的相對豐度下降，變形桿菌和梭菌門的相對豐度增加，其中鏈菌科的增加與肝硬化嚴重程度呈顯著正相關趨勢。研究[29]表明，腸道菌群變化可以提示肝硬化進展，且在此研究基礎上，可以通過關注腸道微生物群的變化幫助研發新的治療肝硬化的方案，以腸道微生物作為慢性肝病治療靶向。

4 二代測序目前的挑戰

目前，二代測序技術在病原學診斷方面顯示了獨特的優勢，其快速、精準的特性很好地補充了病原學診斷方法。然而，對于一些胞壁較厚，難裂解的真菌或細菌，二代測序在測序時存在一定的假陰性[30]。此外，測序覆蓋度與病原體基因組大小有關，病毒的測序覆蓋度遠高于細菌、真菌及寄生蟲，測序時可能導致致病菌判斷失誤或遺漏[31]。并且，二代測序在正常健康人血液和糞便中可以檢測到多種微生物的存在，肝硬化患者亦如此。因此，判斷測序檢出的微生物為致病菌還是污染菌極為重要。其測序結果的判讀往往還需要與臨床相結合，目前為止尚未單獨依靠測序結果判斷污染菌或致病菌，這是二代測序的局限性。二代測序是基于對標本的游離DNA檢測，但死菌釋放的游離DNA也是可檢測的，若患者接受抗生素治療[32]或合并創傷、腫瘤[33]，其測序結果也會隨之被影響。Rogers等[34]在提取DNA之前，采用疊氮溴化丙錠預處理標本可以清除死菌釋放的游離DNA，雖然此方法未經過其他研究驗證，但仍值得參考。二代測序是提取標本中的全部核酸片段加以檢測，理論上可以檢測細菌耐藥基因的核酸序列。但是往往測序結果只能達到鑒別微生物種屬的級別[35]，并不能全面檢測耐藥基因。因此，治療時抗生素選擇還是要靠臨床醫生的經驗。上述問題均需要日后更為深入的研究、探索。但可以肯定的是，隨著測序技術、生物信息學的迅速發展，在未來幾年內臨床測序應用將越來越廣泛。