腐植酸對土壤微生物和酶活性的影響

董睿瀟 莫力聞 劉丹陽 施嘉明 史 記 元 野 馬獻發*

1 東北農業大學資源與環境學院 哈爾濱 150030

2 中國煙草總公司黑龍江省分公司牡丹江煙草科學研究所 哈爾濱 150001

土壤微生物與酶活性是表征土壤肥力的重要指標，兩者在土壤的物質轉化和能量流動過程中起著極其重要的作用[1]。土壤微生物作為土壤生態系統的重要組成成分，參與并推動著土壤有機質的分解和礦質元素的轉化[2]。其中，微生物量碳、氮被認為是土壤中植物有效養分的儲存庫和植物生長可利用養分的重要來源[3]。土壤酶是土壤生態系統新陳代謝的重要動力，也是土壤中各種生物化學反應良好的催化劑[4]，其活性可以反映出不同土壤生物化學反應的相對強度和土壤的養分狀況[5]。例如，土壤蔗糖酶、脲酶、磷酸酶等水解酶活性能夠表征土壤碳、氮、磷等養分的轉化強度[6]。腐植酸是廣泛存在于自然界中的一類芳香族富含酸性基團的高分子縮合物[7]，通常呈黑色或褐色的膠體狀態。由于腐植酸具有良好的吸收、絡合、交換、緩沖能力和生理活性，它在改良土壤結構和提高土壤肥力等方面具有重要作用，同時也會直接或間接影響土壤微生物和酶活性。

雖然已有試驗證明，施用腐植酸能促進土壤微生物的活動，顯著增加土壤細菌、真菌、放線菌的數量和提高土壤酶活性。但腐植酸與土壤微生物及土壤酶活性關系的研究還有待于進一步完善[8]。本文在介紹施用腐植酸對土壤微生物數量、多樣性和參與碳、氮、磷轉化等關鍵酶活性影響的基礎上，對腐植酸改善土壤微生物和酶活性的作用機理進行綜述，以期為腐植酸在提高土壤質量等方面的應用研究提供參考。

1 腐植酸對土壤微生物及酶活性的影響

1.1 腐植酸對土壤微生物的影響

1.1.1 腐植酸對土壤微生物量的影響

土壤微生物量是指土壤中除了活的植物體（如植物根系等）外，體積小于5×103μm3的生物總量[9]，是土壤有機質中最活躍和最易變化的部分[10]。土壤微生物量代表了參與土壤中養分循環和有機物質轉化的微生物數量[11]，是衡量土壤肥力水平和土壤質量的重要生物學指標[12]。

廣義的土壤微生物量包括微生物量碳、氮、磷、硫等。已有研究證實，施用褐煤腐植酸能顯著增加土壤微生物量碳、氮、磷含量，且連續施用年限越久，增強效果越好；但褐煤腐植酸對土壤微生物量碳、氮、磷含量影響程度不同，多年施用后對土壤微生物量磷的影響大于對土壤微生物量碳、氮[13]。此外，腐植酸與土壤改良劑結合起來施用更能充分發揮其增加土壤微生物量的潛力?，F有研究證實腐植酸與生物炭配合使用具有累積效應，對土壤微生物量碳、氮、磷的增長幅度更大[14]。

1.1.2 腐植酸對土壤微生物數量的影響

施用腐植酸能顯著提高土壤三大類群微生物（細菌、真菌和放線菌）的數量。首先，不同用量水平的腐植酸均可明顯增加土壤中三大類群微生物的數量[15]。其次，當選取其他等養分的施肥處理作對比時，腐植酸肥處理的土壤中三大類群微生物的數量明顯高于這些施肥處理[16]，這進一步明確了腐植酸對土壤微生物數量的促進作用。

隨著腐植酸用量的增加，土壤微生物菌群數量呈現先上升后下降的趨勢。袁婉潼[17]和Sellamuthu等[18]試驗發現，雖然施用腐植酸會顯著增加土壤中各類微生物的數量，但隨著腐植酸投入量的增加，各種微生物的數量均表現出先增加后減少的變化規律。

不同用量的腐植酸對三大菌群數量的影響效果不同。研究表明，相較于不施肥處理，腐植酸處理的種群數量同比增長顯著，且提高幅度以細菌最高，真菌次之，放線菌最低[19]。

1.1.3 腐植酸對土壤微生物多樣性的影響

土壤微生物多樣性是指土壤生態系統中所有的微生物種類、它們擁有的基因以及這些微生物與環境之間相互作用的多樣化程度，可以從物種多樣性、功能多樣性、結構多樣性及遺傳多樣性等不同層面分析[20]。

腐植酸對土壤微生物群落物種變化度、差異度和均一性具有一定影響。相關試驗證明，施用腐植酸的土壤微生物群落的Shannon指數（評估物種豐富度）和McIntosh指數（評估物種均勻度）均顯著增長，且在一定程度上隨腐植酸的施用量增加而增加。Yi等[21]也證實這一觀點，在土壤中加入不同質量比的腐植酸（0.2%～1.5%）可增加微生物群落的豐度，低劑量的腐植酸（0.2%）對微生物群落沒有明顯影響，高劑量的腐植酸（0.5%～1.5%）對微生物群落有明顯影響，例如將甲烷桿菌的相對豐度從13.7%提高到23.7%，深古菌的相對豐度從8.9%提高到45.6%。由此可見，在一定的濃度范圍內腐植酸能提高土壤微生物群落物種的豐度和均勻度[22]。高通量測序技術也證實了腐植酸可以顯著增加細菌和真菌的多樣性，在玉米抽雄期和生育期，用量為3.75 t/hm2腐植酸處理的細菌OTUs（定義為97%的序列相似性）數量相比不施肥處理提高7.44%和4.82%。在玉米六葉期、抽雄期和生育期，腐植酸處理的真菌OTUs數量相比不施肥處理提高28.92%、30.81%和8.73%[23]。

同樣，腐植酸可以通過改善土壤微生物的整體代謝活性影響其多樣性。通常選定平均顏色變化率（AWCD）反映土壤微生物的代謝活性和其對碳源的利用程度，其值越大，表示微生物密度越大，活性越高[24]。劉佳歡等[25]的試驗研究發現，施用腐植酸肥料可以顯著提高土壤微生物的AWCD，且施用量越多，AWCD越高。譚兆贊等[26]的試驗發現，生化腐植酸處理的AWCD較等養分無機肥對照最大提高39.3%。因此，可以認為施用腐植酸肥料能促進土壤微生物的整體代謝活性，增強微生物對碳源的利用能力。

1.2 腐植酸對土壤酶活性的影響

1.2.1 腐植酸對土壤脲酶活性的影響

脲酶是一種作用于線型酰胺鍵的酶，它能催化尿素水解生成氨、二氧化碳等小分子無機化合物[27]，是參與土壤氮循環過程的一種重要的酶。整體來看，腐植酸對土壤脲酶活性具有一定的抑制作用。研究表明，在施肥區或無肥區的土壤上增施腐植酸都會對原有條件下的土壤脲酶活性起到抑制作用[27]。從作用時期來看，腐植酸一般在作物生育前期表現出對脲酶活性的抑制作用，而在后期卻無明顯的抑制作用或表現出對土壤脲酶活性的促進作用。李作梅等[28]的研究證實了這一觀點，他們發現不同施肥處理下的土壤脲酶活性變化趨勢是相同的，但施用腐植酸肥料處理的土壤脲酶活性同比前期降低，后期提高。此外，3種不同來源的腐植酸對土壤脲酶活性的影響程度存在一定的差異。在培養前期均表現出對土壤脲酶活性的抑制作用，且以褐煤腐植酸表現最佳，泥炭腐植酸次之，風化煤腐植酸再次之。這有利于抑制尿素的水解，延長尿素的肥效；而在培養后期，泥炭腐植酸對脲酶活性具有一定的促進作用，這有利于后期尿素肥效的發揮[29]。

1.2.2 腐植酸對土壤過氧化氫酶活性的影響

土壤過氧化氫酶促進過氧化氫分解生成水和氧氣，有利于防止過氧化氫對土壤和植物的毒害作用[30]。關于腐植酸對土壤過氧化氫酶的影響，科學界一直持有兩種觀點。多數學者認為，腐植酸具有提高土壤過氧化氫酶活性的能力。腐植酸的施入促進了土壤微生物的活動，加強了土壤氧化過程的強度[31]，且試驗證實，腐植酸通過降低鎘的有效性而增加過氧化氫酶的活性[32]。但也有人持有相反的觀點，認為腐植酸具有抑制土壤過氧化氫酶活性的能力。一方面是在施用腐植酸多年后，某些用量水平下的腐植酸呈現出抑制土壤過氧化氫活性的效果[33]；另一方面，有試驗證實泥炭、褐煤和風化煤來源的腐植酸處理均能夠對過氧化氫酶活性起到抑制作用，使土壤去除土體內過氧化氫的能力減弱，且以褐煤腐植酸的抑制作用最為突出，其次為風化煤腐植酸，泥炭腐植酸的作用最弱[29]。這些研究結果的差異可能與施用腐植酸種類、施用量、時間、施用方式及試驗提供的土壤類型不同有關。因此，腐植酸對土壤過氧化氫酶活性的影響有待進一步試驗驗證。

1.2.3 腐植酸對土壤磷酸酶活性的影響

磷酸酶能夠催化土壤有機磷化合物礦化，其活性高低直接影響著土壤中有機磷的分解、轉化及生物有效性，是評價土壤磷素轉化方向的重要指標[34]。腐植酸能夠顯著提高土壤酸性磷酸酶的活性，腐植酸和無機肥配合施用具有累加效應，其處理對改善酸性磷酸酶活性的效果更佳[35]。對于中性磷酸酶而言，不同來源的腐植酸對其活性具有不同程度的促進作用。以褐煤腐植酸最佳，風化煤腐植酸次之，最后為泥炭腐植酸。此外，不同來源的腐植酸對酶活性的作用時期也不同，褐煤腐植酸在整個培養期對中性磷酸酶活性起到較好的促進作用；風化煤腐植酸僅在培養前期對其活性表現出最佳效果；而泥炭腐植酸在培養期對中性磷酸酶的活性促進作用不明顯[29]。此外，腐植酸的施入，同樣也能改善堿性磷酸酶的活性，使難溶態磷活化并轉變為有效態磷，加速了土壤磷循環過程。Sellhmutlu等[18]的研究則進一步發現，不同用量的腐植酸和無機肥料配合施用對堿性磷酸酶活性起到了一定程度的促進作用，但隨著腐植酸施用量的增加，作用效果先加強后減弱。從改善磷酸酶活性的角度來看，腐植酸能夠適用于不同酸堿環境的土壤，并在一定用量范圍內可以顯著增強土壤磷素的有效性。

1.2.4 腐植酸對土壤蔗糖酶活性的影響

蔗糖酶能促使蔗糖分解成葡萄糖和果糖，是參與土壤碳循環重要的酶。它不僅能夠表征土壤生物學活性強度，也能評價土壤熟化程度和土壤肥力水平[30]。通過大量試驗分析得出，常量或減量施肥的基礎上增施腐植酸可明顯增強土壤蔗糖酶活性，并從整體表現來看，腐植酸復合肥處理的蔗糖酶活性高于等養分復合肥和不施肥處理。此外，不同用量的腐植酸對土壤蔗糖酶的活性具有不同程度的增強作用。并不是用量水平越高，其對酶活性作用效果越好，在一定范圍內，蔗糖酶活性隨著腐植酸用量的增加而增強[36]。有研究發現，相比不施腐植酸的處理，腐植酸用量為60、120和300 kg/hm2蔗糖酶活性分別同比增長6.03%～27.13%、25.86%～51.87%、21.12%～38.32%，以腐植酸用量為120 kg/hm2的作用效果最好，超出120 kg/hm2反而會降低其對蔗糖酶活性的促進作用。在實際生產中，腐植酸的最適用量因各地區的土壤理化性質和栽培方式的不同而有所差別，各地區要進行田間試驗找出相適應的腐植酸合理用量范圍，在所限條件下充分發揮腐植酸的最大效應。可見，適宜的施用方式和用量的腐植酸能夠顯著提高土壤蔗糖酶活性。然而，不同來源的腐植酸對土壤蔗糖酶活性的作用效果不同。風化煤腐植酸及泥炭腐植酸均能顯著提高土壤蔗糖酶的活性，且風化煤腐植酸對蔗糖酶活性的影響更大，褐煤腐植酸對蔗糖酶活性的影響不明顯[29]。

2 腐植酸對土壤微生物及酶活性的作用機理

2.1 腐植酸對土壤微生物的作用機理

腐植酸直接影響土壤微生物的生理活動[37]，腐植酸對微生物膜透性的增強作用被認為是刺激微生物生長和代謝的原因[38]。腐植酸為兩性膠體，表面活性大，易被微生物細胞膜吸附，可通過與營養元素的絡合、螯合或緊密吸附，增強微生物對營養元素的吸收和轉運，加快微生物細胞內生理生化反應速率。

腐植酸可作為微生物體內呼吸作用的電子受體，促進能量的合成，進而促進微生物生長和繁殖[39]。有研究表明[40]，一些土壤微生物可以利用腐植酸作為有機化合物和氫的厭氧氧化電子受體，在電子傳遞過程中產生支持微生物生長的能量。而且微生物還原腐植酸也增強了微生物還原其他不易反應的電子受體的能力，如不溶性的鐵氧化物，腐植酸可以在微生物和鐵氧化物之間傳遞電子。

此外，腐植酸還可以通過改良土壤結構、理化性質和營養狀況來間接影響微生物。①腐植酸為土壤微生物提供營養物質和能量來源。土壤微生物營養主要包括碳、氧、氮等大量元素以及一些礦質元素。腐植酸具有吸附、絡合、螯合、離子交換和氧化還原功能，能將NH3-N吸收固定轉化為有效的NH4

+-N，N2O轉化為NO3-，可減少土壤氮素以NH3-N和N2Ox形態的揮發損失；腐植酸與Al3+、Fe3+、Ca2+、Mg2+等金屬離子發生絡合反應，減少或避免它們對磷的固定作用[41]，也可與難溶性中微量元素發生螯合反應，生成溶解度好且易被微生物吸收的腐植酸與微量元素螯合物[42]，能將土壤中難溶性磷、鉀、中微量元素轉化為有效態養分，提高土壤中無效態養分的有效性[43]，從而為土壤微生物提供更充足的營養。此外，腐植酸含有碳、氫、氧等元素，在分解過程中這些元素釋放出來為土壤微生物提供碳源和氮源，供微生物生長和繁殖。②腐植酸為土壤微生物提供了適宜的生存環境。土壤微生物生存需要適宜的溫度、水分、pH及通氣狀況等。腐植酸中活性官能團羥基、羧基可與土壤中二價離子（如Ca2+）發生凝聚反應，再經過植物根系的生理作用促進土壤團粒結構的形成[44]，使土壤中分散的顆粒膠連在一起，有效降低土壤容重、增加土壤孔隙度和持水量，改善土壤團聚體的穩定性和大團聚體的微觀結構[45]，從而優化土壤中的液相、氣相物質及土壤熱狀況[42]。此外，腐植酸分子結構中含有羥基和酚羥基等弱酸性官能團，使其具有良好的緩沖性能，腐植酸與其鹽類形成一套緩沖體系，以此來調節和穩定土壤pH，從而促進土壤微生物的繁殖和活動，增加土壤微生物的數量和種類。

總的來說，凡是土層深厚、質地疏松、理化性質優良、有效養分含量較高的土壤中微生物量比較高[46]。腐植酸不僅有效地改善了土壤的結構特性，而且儲存和提供了豐富的有益元素和活性因子[47]，腐植酸是土壤肥力的核心物質，對微生物具有明顯促進作用。

2.2 腐植酸對酶活性的作用機理

眾所周知，在農業生產中腐植酸常常被用作脲酶抑制劑。而腐植酸之所以能夠抑制脲酶活性，一方面腐植酸中大量不飽和化學鍵具有提高土壤抗氧化的能力，可以有效避免脲酶的生物活性官能團-巰基（–SH）被氧化，另一方面腐植酸還能螯合Cu2+和Hg2+，這2種重金屬是常見的土壤脲酶巰基的抑制劑[48]，它們與巰基結合后，使脲酶活性中心的性質與結構發生變化[49]，最終使脲酶的活性受到抑制。近期相關研究認為，脲酶活性位點通道的開啟和關閉是由2個半胱氨酸殘基（αCys322）負責調節，αCys322可以調控轉運的底物和產物通過活性中心通道。αCys322的巰基基團可以與苯醌或鄰苯二酚進行加成反應形成共價化合物，從而阻斷脲酶活性，由于腐植酸中含有醌基和酚羥基，當腐植酸添加到脲酶中時，腐植酸中的醌基或酚羥基與脲酶αCys322上的巰基基團發生氧化還原反應，形成脲酶-腐植酸絡合物，由于產物粒徑較大，共價絡合物可能形成空間位阻封閉活性部位通道的入口，從而抑制脲酶的活性[50]。

土壤蔗糖酶主要來源于植物根系分泌物，腐植酸能夠提高土壤蔗糖酶活性，恰恰是因為腐植酸施入土壤中，對植物根系產生一定的刺激作用，進而提高根系的生理活性，增強其分泌物質的能力，使得進入到土壤中的蔗糖酶的量大大增加。隨后腐植酸和蔗糖酶形成了酶-腐植酸復合體，酶結構得到穩定，從而活性得以提高[51]。

土壤磷酸酶活性與土壤腐殖質的含量呈正相關。腐植酸作為土壤腐殖質的重要組分，必然增加土壤中腐殖質含量，相應地也能提高土壤磷酸酶的活性；此外，土壤中的磷酸酶也是來源于植物根系和微生物的分泌物，腐植酸能夠顯著增強植物和土壤微生物向外分泌多種有機物質和酶類的能力[52]。所以說腐植酸對磷酸酶活性具有促進作用。

除此之外，腐植酸對植物根系的刺激作用促使植物根系中三磷酸腺苷酶（ATP酶）相關基因的表達，腐植酸能夠促進作物根系中H+-ATP酶編碼基因亞型MNA2的表達，能夠作為質膜上H+-ATP酶誘導因子提高細胞活性，誘導質膜表面H+-ATP酶數量的增加；同時，H+-ATP酶活性的增加也使電化學質子梯度增加，從而影響酶的活性[53]。腐植酸也能夠對土壤中其他酶的活性產生影響。有研究認為，腐植酸與葡萄糖苷酶之間通過復合或者共價鍵結合的方式形成穩定的復合物，改變了酶的構象或阻礙底物與酶活性位點的結合，從而導致了酶活性的下降[54]。腐植酸施入土壤對酶二級結構中的α-螺旋和無規則卷曲影響較小[55]，不會破壞酶的結構。

總體而言，腐植酸與酶相互作用對酶的活性與穩定性均有保護作用，而腐植酸對植物根系的刺激作用也是影響許多酶活性的重要原因。

3 研究展望

（1）不同種類的腐植酸對微生物和酶活性的具體影響效果和作用時期沒有準確的試驗驗證，可以針對該方面進一步研究，以期精確調控腐植酸對微生物和酶活性的影響，使腐植酸肥料利用率達到最大化，并在最佳的時間發揮其作用。

（2）雖然已有試驗證明，等碳的條件下，不同來源的腐植酸處理對中性磷酸酶活性的促進作用存在一定差異，但并未說明對酶活性促進程度的具體值，不同用量的腐植酸對酶活性的影響也未有報道，有待進一步研究。

（3）同種腐植酸肥料在施用濃度和施用時間不同時，對微生物和酶活性的影響效果及作用機制有待深入研究。

（4）同種腐植酸施入理化性質不同的土壤中，對微生物和酶活性的影響效果是否一致，對指導不同地區施用腐植酸具有重要意義，值得深入研究。

（5）腐植酸結構對微生物和酶活性影響的作用機理還需完善，腐植酸結構對微生物生長、蔗糖酶、磷酸酶的作用機理仍然需要進行深入研究，以期更好地利用腐植酸改善土壤狀況，提高土壤質量。