一株兼具產IAA能力纖維素降解菌的篩選、鑒定及條件優化

吳婧 聶彩娥 朱媛媛 黃薇 馬超 姜瑛 朱林 郜紅建

（1. 農田生態保育與污染防控安徽省重點實驗室，安徽農業大學資源與環境學院，合肥 230036；2. 中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所，北京 100081；3. 河南農業大學資源與環境學院，鄭州 450002）

沿淮地區農作物秸稈產量豐富，但秸稈還田利用率卻不高，這是因為自然狀態下還田腐解緩慢，會影響耕作和作物生長［1］。砂姜黑土是沿淮地區的主要土壤，是典型的中低產土壤類型之一，土壤養分貧乏加之秸稈腐解緩慢不利于下茬作物的萌發和生長［2-3］。如何加速秸稈的腐解和養分釋放已成為沿淮地區迫切需要解決的問題。

添加腐稈劑能夠有效加速還田秸稈的降解，使其短時間內轉化成有機肥、釋放營養元素［4］。然而，由于砂姜黑土耕層土壤肥力低、理化性狀差，外源微生物難以在其中存活和發揮功效，這造成功能菌來源非砂姜黑土中的腐稈劑在砂姜黑土上的應用效果較差［5-6］。研究表明，在目標地篩選的菌株對原有環境的適應性更強，不僅易于存活還可避免對原環境微生物種群的擾動，能夠解決外源菌株應用效果不佳等問題。例如，Sun等［7］針對農業秸稈在寒冷地區難以降解的問題，從中國寒冷地區的土壤中篩選具有抗低溫能力的纖維素降解細菌LKR-1提升農業秸稈的降解速率；Jha等［8］為解決土壤鹽分制約植物生長的問題，從鹽生植物的根中篩選出耐鹽菌株提高受鹽影響地區作物的產量；賀軍軍等［9］從甘蔗渣中分離出高效淀粉降解菌，其能夠快速降解甘蔗渣縮短堆肥時間，促進甘蔗渣肥料化發展。鑒于砂姜黑土中也有大量參與秸稈降解的微生物，且其對砂姜黑土特殊的理化性狀較為適應［10］。因此，通過從砂姜黑土中篩選秸稈降解菌來創制腐稈劑有望提高菌株存活差及其引起的促腐效率低等問題。

沿淮砂姜黑土區的耕作制多為茬口短暫的麥玉輪作，還田腐解不及時的小麥秸稈會導致土壤空隙，造成下茬的玉米種子無法與土壤充分接觸，生長受到負面影響［11］。研究表明，植物促生菌可產生植物激素直接刺激幼苗生長［12］。例如，細菌分泌的吲哚-3- 乙酸（Indole-3-acetic acid，IAA）可參與植物的發育過程，促進植物生長［13］。因而，如果從砂姜黑土上篩選出的秸稈降解菌兼具植物促生功能，那么其應用前景將更為廣闊。為了滿足農業生產中面臨的多方面需求，越來越多的研究人員嘗試選育具備多重功能的菌株。例如，萬兵兵等［14］針對煙區土壤中養分缺乏、煙草生長不佳的問題，從煙草根際中分離兼具解磷和解鉀功能的根際促生菌提高土壤中磷、鉀的含量，促進煙草生長；駱婷等［15］從森林土壤中篩選出同時降解纖維素、淀粉、蛋白質及油脂的多功能資源菌株，在提高農業耕地土壤肥力和改善農作物品質等方面作用顯著。由上，秸稈還砂姜黑土田時配施具有產IAA能力的秸稈降解菌為核心的腐稈劑或可解決該區秸稈直接還田利用面臨的兩大難題。

本研究擬從連續多年進行秸稈還田的砂姜黑土試驗田中篩選出兼具高產CMC酶（內切-β-1，4-葡聚糖酶）和IAA能力的菌株，通過秸稈腐解和玉米促生試驗驗證其實際促腐和促生效用，并探究其生長、產CMC酶和IAA的最佳培養條件，以期為適用于砂姜黑土區麥玉輪作制度的腐稈菌劑開發及應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 土壤采自安徽省蒙城縣內農業示范科技園區長期秸稈還田試驗小區的砂姜黑土，有機質12.5 g/kg，全氮0.137 g/kg，堿解氮80.2 mg/kg，速效磷15.4 mg/kg，速效鉀100.3 mg/kg。秸稈和玉米種子分別為安徽省蒙城縣農業示范科技園區的小麥秸稈和市場上購買的“鄭單958”。

1.1.2 培養基 LB培養基，無機鹽培養基，液體發酵培養基，富集培養基和羧甲基纖維素培養基［16-17］。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離、篩選 稱取 10 g土壤樣品接種于90 mL無菌水中，28℃，150 r/min搖床震蕩30 min。取1 mL土壤懸液，加入9 mL無菌水，制成濃度為10%的原液，用LB瓊脂平板進行連續稀釋培養分離出細菌。在（30±2）℃溫度下培養直至出現菌株，單個菌落被選取并在LB平板上劃線進一步純化。將分離、純化獲得的菌株分別接種在羧甲基纖維素鈉選擇培養基上，通過水解透明圈的大小定性分析其纖維素降解功能［16］。

1.2.2 CMC酶（endo-1，4-β-D-glucanase，內 切-β-1，4-葡聚糖酶）活測定 將菌種接種于以玉米秸稈粉為唯一碳源的液體培養基中37℃液體搖瓶培養60 h，把發酵液于4℃、5 000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液。參照DNS（3，5-二硝基水楊酸）法測定酶液中還原糖含量［18］。酶活性的一個單位（U）定義為在溫度為50℃、pH值為4.8的條件下，1 mL酶溶液每分鐘釋放相當于1 μmol還原性糖的酶量。

1.2.3 IAA含量測定 將具有纖維素降解功能細菌接種于含有L-色氨酸（100 mg/L）的LB液體培養基，30℃，180 r/min培養1 d，然后10 000 r/min離心10 min，將2 mL上清液與等體積Salkowski比色液混合，室溫遮光靜置30 min，根據標準曲線在530 nm波長處的光譜吸光度測量來計算IAA含量［19］。

1.2.4 菌株的鑒定 形態鑒定和生理生化特性研究參考文獻［20-21］。細菌基因的提取及16S rDNA擴增參照文獻［22］，將獲得的16S rDNA序列在GenBank數據庫中做比對，Blast搜索同源序列，使用MEGA5.0軟件，用Neighbour-Joining法構建系統發育樹，結合形態學和生理生化特征確定菌株的名稱。

1.2.5 菌株實際秸稈降解能力研究 稱取粉碎后過20目篩的小麥秸稈粉5 g于250 mL三角瓶中，加水30 mL，加硝酸鈉2 g，加濃度為1×108CFU/mL離心重懸到無菌水中的菌液10 mL，28℃、120 r/min條件下恒溫振蕩，培養15 d后將培養物離心（5 000 r/min 10 min）棄上清液，用蒸餾水反復清洗側壁，80℃烘干至恒重，另設無菌水替代菌液，其他步驟一致，作為對照處理，每個處理3個重復，秸稈腐解率采用失重率法［16］。

1.2.6 菌株的實際玉米促生作用 取田間耕作層土壤，除去礫石及雜草枯枝后，混勻過5 mm孔徑篩，每盤裝土5 kg。設置兩個處理，每個處理重復5次。對照處理（CK）：土壤中接種滅活細菌n3；接菌處理（n3）：土壤中接種細菌n3。用0.1%的HgCl2對玉米種子進行表面滅菌10 min后，用無菌蒸餾水沖洗5次。將細菌n3接種于LB培養基中，37℃ 150 r/min搖床培養48 h，然后將培養物離心（5 000 r/min 10 min），再重懸于無菌水中至密度為1×108CFU/mL，最后在土壤中接種。玉米種子每盆播種5粒，并將土壤含水量調至田間最大持水量的60%，49 d后對每種處理的5個重復樣品取樣，測量玉米的根長、表面積、根尖數、株高、SPAD值和植株鮮重等。

1.2.7 玉米生物學性狀測定 玉米株高和 SPAD 值分別選用鋼卷尺和 TYS-A 型葉綠素測定儀測定；地上部鮮種用百分之一天平進行測定［23］。玉米根系長度、直徑、表面積用根系掃描儀（LA1600+ scanner，Canada）獲取單個植物的根圖像進行測定［19］。

1.2.8 菌株的最佳生長、產酶和產IAA條件研究

1.2.8.1 不同培養條件對菌株產CMC酶的影響 將菌種接種于以小麥秸稈粉為唯一碳源的液體培養基中37℃液體搖瓶培養，設置不同初始pH（4、5、6、7、8、9和10）、不同裝液量（25、50、75、100和150 mL/250 mL）、不同氮源（硝酸鉀、硫酸銨、硝酸銨、酵母粉、谷氨酸、尿素、蛋白胨），培養60 h后用分光光度計測定其OD520值計算菌株產CMC酶的含量。

1.2.8.2 不同培養條件對菌株生長和產IAA能力的影響 將含有100 mg/L L-色氨酸的50 mL LB液體培養基裝于250 mL三角瓶中，按照體積分數1%的接種量接種菌株，30℃，180 r/min搖床培養。設置不同初始pH（4、5、6、7、8、9和10），裝液量（25、50、75、100和150 mL/250 mL），不同氮源（硝酸鉀、硫酸銨、硝酸銨、酵母粉、谷氨酸、尿素和蛋白胨），培養24 h后測定菌株生長情況（OD600）和產IAA能力（OD530），每個處理設3個重復。

2 結果

2.1 不同供試的菌株CMC和IAA生產能力比較

從長期秸稈還田砂姜黑土中篩選出8株纖維素降解細菌n1、n2、n3、n4、n5、n6、n7和n8（圖1）。菌株n3產生的CMC酶活最高，可達20.60 U/mL 顯著高于其他菌株；其次是n2，CMC酶活力為17.98 U/mL，其他菌株間CMC酶活力無明顯差異（圖1-A）。n3菌株產IAA能力也是最強的，濃度可達20.15 mg/L，顯著高于其他菌株（P＜0.05），n2、n6、n7菌株均無IAA產生（圖1-B）。因此我們選取菌株n3為具有降解纖維素和合成IAA的多功能菌株，并進行秸稈降解試驗和盆栽試驗驗證其促腐和促生效果。

圖1 不同菌株產CMC酶（A）和IAA能力（B）

2.2 供試菌株n3的形態、生理生化及遺傳性狀

對菌株的形態特征進行觀察，發現n3菌株表面光滑，菌落較小，邊緣整齊，不透明，略帶黃色，不規則桿狀排列（圖2-A）；菌株呈稍彎曲或弧狀的桿狀（圖2-B）。對n3菌株進行革蘭氏染色、甲基紅反應（M.R）和 V-P 試驗、好氧性試驗和接觸酶試驗后得到其生理生化結果。由表1可知，n3菌株是革蘭氏陰性的好氧菌，其明膠液化、V-P 試驗、甲基紅反應（M.R）、檸檬酸鹽利用、淀粉水解項目均呈現陰性反應，接觸酶利用則呈現陽性反應。將n3菌株的16S rDNA序列與NCBI數據庫Blast進行同源性比較，并采用MEGA 5.0構建系統發育樹（圖3）。根據圖3，n3菌株與固氮螺菌（Azospirillum zeae）的同源性最高，親緣關系最近。結合形態學分析和生理生化特征結果，n3菌株被鑒定為玉米固氮螺菌。

圖2 菌株n3的菌落形態觀察（A）和革蘭氏染色（B）

表1 菌株n3的生理生化特征

圖3 基于n3和相關菌株的16S rDNA序列采用鄰接法建立的系統發育樹

2.3 菌株n3的秸稈促腐和植物促生能力

液態搖瓶試驗表明，接種n3處理的小麥秸稈降解率達到15.1%，較對照提高了54.71%（P＜0.01，表2）。與對照相比，玉米植株和根系性狀在接菌后也有顯著改善，根長、平均直徑、SPAD值分別顯著增加18.3%、22.0%和5.24%（P＜0.05，表2）。

表2 接種菌株n3對秸稈促腐和玉米生長的影響

2.4 菌株n3的最佳生長、產CMC酶和產IAA條件分析

n3生長狀況在不同初始pH時差異顯著（P＜0.05）；當pH為4.0和5.0時，菌株n3不生長，而當pH為6.0時，菌株生長量達到最大（圖4-A）。當250 mL三角瓶裝液量為25 mL時，菌株n3生長狀況達到最優，隨著裝液量的增加，n3菌株的生長呈逐漸下降趨勢（圖4-B）。氮源促進菌體生長的順序為：酵母粉＞蛋白胨＞谷氨酸＞尿素＞硫酸銨＞硝酸鉀＞硝酸銨（P＜0.05，圖4-C）。

隨著pH增加，n3的CMC酶活呈先升后降的趨勢，在pH值為5.0時，CMC酶活力最高，達到24.96 U/mL（圖4-D）。n3的CMC酶活隨裝液量的增加呈先降后升的趨勢，三角瓶裝液量為25 mL（1/10）時，CMC酶活力最高，為15.33 U/mL（圖4-E）。盡管不同氮源對n3產CMC酶能力的影響較對生長的小，但最佳氮源依然為酵母粉，此時CMC酶活達18.30 U/mL（圖4-F）。n3產IAA的最適pH為6.0，產生量達到19.03 mg/L，在pH 6.0-8.0之間，菌株產IAA含量較高且相對穩定，顯著高于其余pH時的產量（P＜0.05，圖4-G）。n3產IAA的最佳裝液量為25 mL，產量可達22.67 mg/L，顯著高于其他裝液量處理（P＜0.05，圖4-H）。不同氮源下n3產IAA量的大小順序為：酵母粉＞蛋白胨＞谷氨酸＞硫酸銨＞硝酸鉀＞硝酸銨＞尿素。當以酵母粉和蛋白胨為氮源時，n3的IAA產生較多，分別可達32.31 mg/L和24.78 mg/L（圖4-I）。

3 討論

3.1 菌株n3產CMC酶能力及對秸稈降解的影響

從砂姜黑土中篩選出的菌株n3的產CMC酶能力高達20.60 U/mL。已研究發現多種纖維素降解菌株，如韋中等［24］分離獲得的腐解菌ZJA-6表現出的CMC酶活為13.20 U/mL；李林超等［25］篩選出一株降解纖維素的放線菌C31酶活達4.8 U/mL；Liang等［26］報道的伯克霍爾德菌ME27-1在優化條件下酶活僅為2.08 U/mL。菌株n3的CMC酶活力分別是菌株ZJA-6、C31、ME27-1的1.56倍、4.29倍、9.90倍，說明菌株n3具有相對較高的CMC酶活力。需要注意的是，菌株的實際促腐應用效果需要結合CMC酶活和秸稈降解試驗綜合判斷［27］，這是因為秸稈是由纖維素、半纖維素和木質素通過共價鍵、氫鍵和蠟鍵等多種分子作用力連接組成的不溶于水的高分子化合物，纖維素外部被木質素和半纖維素緊密包裹，難以被纖維素酶分解［28］。秸稈降解試驗顯示，菌株n3在15 d秸稈腐解率達15.1%，相對于自然降解秸稈降解率提升了54.71%，相對于韋中等［24］篩選的細菌ZJA-6在相同時間內秸稈降解率提升了28.3%，說明添加菌株n3可明顯提升秸稈降解效果且優于其他菌株。由此，本研究篩選的菌株n3不僅表現高酶活性還可以加速秸稈降解的進程，在實際應用中有望提高秸稈的綜合利用率。

3.2 菌株n3產IAA能力及對植物促生的影響

IAA在植物體內參與許多生理生化的調節和控制，如細胞的伸長生長、形成層細胞的分裂等，能夠促進植物生長［29］。本研究從砂姜黑土中篩選出的菌株n3 的IAA分泌量可達20.15 mg/L，顯著高于當前土壤中所篩菌株的平均水平［30-32］。由于植物生長隨IAA濃度增大表現出低促高抑效應［33］。因此產IAA菌株的促生作用還需要結合盆栽試驗綜合分析。試驗表明，接種菌株n3的玉米植株的SPAD值較對照顯著增加。這可能是由于SPAD值表示植株的葉綠素含量，其值越高則表明植株光合作用能力越強，菌株n3屬于固氮菌，接種后能夠促進玉米對硝態氮的吸收積累，氮是葉綠素的重要組分，因此顯著提高了玉米植株的SPAD值［19，34］。接種菌株n3的根長和平均直徑增大，說明經過接菌處理的玉米形成了更為發達的根系，證實了前人關于微生物產生的IAA能促進細胞的分裂、分化和改變植物的根系形態的論點［35］；根表面積相較于對照提升不明顯，可能與外源壓力和土壤類型有關［36］。根系狀況直接影響植物生長和營養供應，發達的根系能夠充分與土壤中的養分進行交互，從而提高養分利用促進生長［19］。然而，本研究中接菌玉米的株高、地上部鮮重較對照分別增加5.0%、5.4%，未達到顯著相關水平，這可能歸因于植物種類和栽培條件的影響［37］。

圖4 不同培養條件對菌株n3生長狀況、產CMC酶活力和IAA能力的影響

3.3 菌株n3的生產和應用優化

發酵培養基為菌株的生長繁殖提供營養物質，因此對其進行優化能夠最大限度促進菌株生長，縮短發酵周期，為工業生產提供參考［38］。本試驗菌株n3在pH為6時生長最佳，這與菌株篩選的砂姜黑土pH為6.32相一致，然而Anandham等［39］和Han等［40］分別從牛糞、微生物燃料電池中分離出的固氮螺菌在pH為7時生長最佳，這可能與菌株篩選環境有關。環境及添加物的化學性質等，都能顯著影響菌株代謝產物的活性，優化培養條件能夠為微生物菌劑的應用提供理論支撐［41］。菌株n3在pH值分別為5、6時產CMC酶和IAA能力最佳，說明菌株n3有較好的耐酸能力，可在偏酸性的砂姜黑土中發揮重要作用。王霞等［42］從土壤中篩選的地衣芽孢桿菌產CMC酶最佳pH為6；張東艷等［43］從花生根際中篩選出的特基拉芽孢桿菌在pH為8時IAA產量最高，這與n3產酶和產素最佳pH不一致，可能是由于菌株種類和土壤類型的差異。本研究的最佳裝液量為25 mL，隨著裝液量的增加，菌株生長、產酶和產素狀況均呈現總體下降趨勢，這可能是由于菌株n3是好氧菌，當裝液量增加時，供氧量減少時，因此阻礙了菌株n3的生長，導致活菌數減少，代謝逐漸減慢，從而使得菌株分泌代謝產物的能力受到抑制。氮源對菌株的迅速增長至關重要，是滿足微生物自身生長繁殖代謝等活動所必需的營養元素。在本研究中，當使用有機氮源酵母粉作為唯一氮源時，菌株n3的生長、產酶和產素效果最優，但以硝酸鉀、硫酸銨、硝酸銨等無機氮源為氮源時優化效果不佳，說明有機氮源優于無機氮源，與Sheng等［44］和Jiang［45］等結果相同。

4 結論

本研究從砂姜黑土中篩獲的玉米固氮螺菌n3，兼具秸稈降解和作物促生能力，其生長、產CMC和IAA最適的氮源均為酵母粉，裝液量均為25 mL/250 mL，而pH分別為6.0、5.0、6.0。以上結論對指導砂姜黑土區多功能秸稈降解菌劑的創制及應用有一定的積極意義，在實際生產中菌株n3適用于土壤通氣性好的微酸性土壤，最佳的配施氮肥為有機氮肥。