溶藻弧菌PepA蛋白原核表達載體的構建及其乙酰化鑒定

徐洲 范晨龍 丁燏

（1. 廣東海洋大學水產學院，湛江 524088；2. 廣東省水產經濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室，湛江 524088；3. 廣東省水產經濟動物病害控制重點實驗室，湛江 524088）

溶藻弧菌是一種嗜鹽嗜溫性革蘭氏陰性條件致病菌，廣泛生長于海洋及出海口［1-2］。它在pH為6-9，水溫為17-35℃時健康生長，其最適生長鹽度與海水鹽度相差不多，所以在海水中常見［3］。它能使多種魚、蝦、貝表皮發生潰瘍、出血及黑斑等，在我國南方尤為嚴重［4］，在人身上表現為與傷口感染和胃腸道疾病相關，且常伴隨水樣腹瀉［5］，它不僅影響了水產養殖行業的發展，更危及人類的健康。

作用于肽鍵上的酶稱為肽酶，肽酶在生物體中與很多功能相關，如蛋白質的消化、細胞內蛋白質的循環等［6］。PepA蛋白作為一種亮胺酰胺肽酶，在愛德華氏菌中PepA蛋白結合到esrB啟動子區域并在早期負反饋調節T3/T6SSs表達的功能［7］，在大腸桿菌中PepA能破壞預先形成的封閉RNA聚合酶-DNA模板復合物，或抑制其在轉錄起始階段向下游階段的進一步行動，所以能抑制carAB操縱子的啟動子P1的轉錄起始，即PepA蛋白就是轉錄阻遏物［8］，PepA蛋白負調控棘突的生物合成，其任何損害都可能影響棘孢菌的菌絲形態和生長［9］。

乙酰化屬于蛋白修飾中多種翻譯后修飾的一種，在枯草芽孢桿菌多細胞性中起著重要的調節［10］。乙酰化修飾既能提高某些蛋白的功能，也能阻遏某些蛋白的功能，如乙酰化修飾過后的黑穗醋栗果實多糖可以顯著提高多糖的自由基清除能力［11］，賴氨酸乙酰化能阻遏小鼠精子中的過度蛋白［12］。但目前將乙酰化修飾在弧菌上的研究少之又少。由于溶藻弧菌的多重耐藥性很高［13］，所以需要新型治療方法。乙酰化修飾GNAT蛋白后會影響水稻細菌性條斑病菌的毒力［14］，能調控PhoP蛋白的活性從而降低鼠傷寒沙門菌的毒力［15］，細菌RplB蛋白的乙酰化會影響其核糖體蛋白的功能［16］，這些都說明乙酰化修飾會直接或者間接影響細菌的毒力，這為我們研究乙酰化修飾對溶藻弧菌的毒力的影響提供了一定的理論支持。

PepA蛋白在溶藻弧菌的功能及其乙酰化調控尚未見相關報道，本研究擬構建溶藻弧菌 HY9901 PepA蛋白的原核表達載體、優化其表達條件，并分析其是否存在乙酰化調控，旨為探究乙酰化蛋白修飾對溶藻弧菌PepA蛋白功能的影響奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

溶藻弧菌HY9901保存在廣東省水產經濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室。表達載體pET-28a由實驗室保存，大腸桿菌BL21（DE3）均購自北京全式金生物公司。細菌基因組提取試劑盒（Easy Pure Plasmid MiniPrep Kit）、質粒提取試劑盒、切膠回收試劑盒購自賽默飛世爾科技有限公司（Thermo Fisher Scientific），一抗是購自Cell Signaling Technology的兔抗乙酰化賴氨酸抗體（Acetylated-Lysine Antibody），二抗是購自科敏生物公司的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG（Goat Anti-rabbit IgG/HRP），封閉液是碧云天的 QuickBlock Western，His標簽蛋白純化介質是碧云天公司的 BeyoGold His-tag Purification Resin（耐變性劑型），CobB（0.1 μg/μL）蛋白為前期實驗室制備。

1.2 方法

1.2.1pepA基因的克隆與構建pET-28a-PepA表達載體 將HY9901菌種加入200 mL TSB培養基中，當OD600nm達0.8時，使用細菌基因提取試劑盒，按說明書提溶藻弧菌HY9901的DNA。根據NCBI上已公布的溶藻弧菌pepA基因（ID：NC_022349.1）序列分別設計含EcoRI和XhoI酶切位點的正反鏈引物，正鏈引物F：CCGGAATTCATGGAGTTCAGTGTAA AAAGTGGC（下劃線為EcoRI酶切位點），反鏈引物R：CCGCTCGAGTTACTCTTCTGTCTCTTGGCCGC（下劃線為XhoI酶切位點）。以溶藻弧菌HY9901的DNA為模板鏈擴增pepA基因，PCR反應體系為95℃ 5 min，95℃ 30 s，53℃ 30 s，72℃ 1.5 min，30個循環，72℃ 10 min。擴增的目的片段用切膠純化試劑盒回收。pET-28a按照質粒提取試劑盒說明提質粒，用EcoRI和XhoI酶切，將切膠回收的產物與酶切后的pET-28a連接，用T4連接酶在16℃連接3 h后轉入大腸桿菌BL21（DE3）感受態中，經無抗性的LB培養基培養1 h再涂布在含kana抗性（100 μg/mL）的平板上，37℃培養過夜，挑取單菌落進行PCR鑒定，鑒定所用引物 序 列 為F：TGCTAGTTATTGCTCAGCGG，R：TAATACGACTCACTATAGGG。鑒定為陽性菌落后經擴大培養送到廣東生工生物公司進行測序，保證pET-28a-PepA載體序列的正確性。

1.2.2 PepA蛋白的誘導表達 將含pET-28a-PepA重組質粒的大腸桿菌BL21（DE3）以1%的體積分數接種于含kana（100 μg/mL）抗性的LB培養基中，37℃，200 r/min培養2 h，再加入體積分數為0.5%的IPTG進行誘導，以不含IPTG的pET-28a-PepA、含IPTG的pET-28a、不含IPTG的pET-28a為對照組。37℃，200 r/min搖5 h后離心收集菌液。隨后用12 000 r/min離5 min再用1 mL的PBS洗，如此重復3次洗掉殘留培養基。采用水煮法提取細菌蛋白進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分析。

1.2.3 PepA蛋白表達條件優化 采用控制變量法，對于不同溫度、時間、IPTG濃度條件下重組菌株的表達效果進行比較。當OD600nm達0.4-0.6時開始誘導。

溫度：分別在37℃和28℃，IPTG濃度為0.5%搖5 h收集10 mL菌液，然后4℃ 6 000 r/min離心30 min，再用5 mL的PBS吹勻沖洗，如此重復兩次。置于冰水混合物中超聲波破碎重組細菌，超聲波程序設置為：功率300 W，超聲開時間5 s，超聲關時間8 s，超聲破碎20 min至菌液清澈透亮即可。然后分裝上清和沉淀，沉淀用8 mol/L尿素在4℃條件下溶解過夜，經過SDS-PAGE后用考馬斯亮藍染色，用Gel-pro Analyzer 分析結果。

時間：在37℃，IPTG濃度為0.5%的條件下，誘導時間設置為1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h和7 h。菌液收集、處理及分析如1.2.2的步驟。

IPTG濃度：在37℃，誘導時間為5 h的條件下，IPTG濃度設置為0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%和2.0%。菌液收集、處理及分析如1.2.2的步驟。

1.2.4 His-PepA蛋白的純化 將最優表達條件下誘導的菌株收集、提取蛋白，使用His標簽蛋白純化介質過柱純化。將蛋白與填料在4℃中孵育過夜，將孵育過夜的蛋白加入純化柱中，按碧云天公司的His標簽蛋白純化介質使用說明書操作。

1.2.5 Western blot驗證PepA蛋白的酰化 驗證CobB蛋白能否在體外將PepA蛋白進行去乙酰化。PBS*（去乙酰化酶磷酸緩沖液）反應體系如下：50 mmol/L Na2HPO4（pH 8.0），100 mmol/L NaCl，1 mmol/L MgCl2，2.7 mmol/L KCl及500 μmol/L NAD+；CobB蛋白和 PepA（0.2 μg/μL）蛋白，充分混合，反應總體積為500 μL。把純化后的融合蛋白E3以300 μL分別加入200 μL PBS*、100 μL NAD+和100 μL PBS*、100 μL CobB和PBS*、100 μL CobB和100 μL NAD+四組中。以加入PBS*的反應作為陰性對照。所有反應體系均置于25℃孵育6 h。待反應完成后，取適量反應體系加入等體積SDS-PAGE電泳蛋白質上樣緩沖液終止反應，使用Western blot法檢測樣品中目的蛋白的乙酰化水平，再用顯色液和自動化學發光圖像分析系統（TAN 5200）拍照記錄。

2 結果

2.1 pepA基因的克隆

挑取菌落經PCR擴增鑒定獲得目的條帶（圖1），電泳后顯示的條帶大小與PepA ORF大小一致。表明pepA基因克隆成功。

圖1 pepA基因的克隆

2.2 重組質粒pET-28a-PepA的構建

重組質粒成功轉入大腸桿菌BL21（DE3）中后進行菌落PCR鑒定，條帶與預測大小一致（圖2），隨即送到廣州生物生工公司進行測序，結果與預測序列完全一致，證明此載體構建成功。

圖2 構建pET-28a-PepA載體

2.3 誘導PepA蛋白表達

將構建成功的重組菌株以37℃、0.5%的IPTG誘導5 h后收集蛋白，結果顯示未誘導的pET-28a、誘導過的pET-28a和未誘導的pET-28a-PepA均不表達，而經誘導的重組菌株得到一條60.7 kD的條帶（圖3），表明pepA基因在表達菌株中成功表達。

2.4 PepA蛋白表達條件優化

2.4.1 溫度對重組蛋白表達的影響 溫度優化結果表明，PepA蛋白在兩個溫度條件下融合蛋白、上清和沉淀均有表達，且包涵體表達量均高于上清。在37℃的情況下，融合蛋白、上清和沉淀分別高于在28℃時的（圖4）。

圖3 PepA蛋白SDS-PAGE電泳分析

圖4 溫度對PepA蛋白表達的影響

2.4.2 IPTG濃度對重組蛋白的影響 結果表明，PepA在體積分數為0.1%-2%的IPTG誘導下表達量無明顯差異，即IPTG濃度對PepA表達量無明顯影響（圖5）。

圖5 IPTG濃度對PepA蛋白表達的影響

2.4.3 誘導時間對重組蛋白的影響 結果表明，PepA蛋白表達量隨誘導時間增加而呈現出先增加后穩定的趨勢，即5 h表達量達到最大且不再有明顯的增加，即誘導時間5 h為最佳誘導時間（圖6）。綜上所述，PepA蛋白最佳表達條件為37℃、0.1%的IPTG和誘導5 h。

圖6 誘導時間對PepA蛋白表達的影響

2.5 His-PepA蛋白的純化

融合蛋白經his親和層析柱純化后，用SDSPAGE進行分析。結果表明，在第3次洗脫（E3）時成功純化（圖7）。

圖7 PepA蛋白的純化

2.6 PepA蛋白的乙酰化鑒定

本研究使用抗乙酰賴氨酸抗體進行了蛋白質印跡分析，以測試PepA的乙酰化水平。結果表明（圖8，line 5）PepA蛋白自身存在乙酰化修飾位點，即Pepa蛋白是個乙酰化蛋白。為了進一步證實PepA和CobB之間的關系，對PepA進行了去乙酰作用，并使用抗乙酰賴氨酸抗體對蛋白質的乙酰化水平進行了分析，1-4的條帶顏色深淺沒有明顯差異，表明CobB蛋白不能調控PepA蛋白的乙酰化修飾程度或者對其調控程度很小（圖8）。

圖8 PepA蛋白的乙酰化鑒定及調控

3 討論

目前關于乙酰化修飾的研究較多，如對認知障礙功能［17］、癌癥相關［18］及肉類品質的影響［19］等研究。目前為止發現了兩種蛋白質乙酰化形式：賴氨酸乙酰化和N末端乙酰化［20］，N末端乙酰化是公認的主要的細胞調節劑［21］，而賴氨酸乙酰化和其他翻譯后修飾聯合起來可以控制整個細胞信號通路［22］。

目的蛋白的產生量很大程度上受原核表達的不同誘導條件的影響，故進行目的蛋白的原核表達條件優化是必要的。本試驗在設置誘導參數時參照溶藻弧菌TolB與dtd基因的原核表達條件優化［23-24］，得出在一定范圍內IPTG濃度不會增加目的蛋白表達量，這與丁軍穎等［25］的IPTG濃度在一定范圍內對丁肝抗原蛋白表達量無影響的研究結果有相似之處；而在37℃時目的蛋白表達量高于27℃，這可能是由于大腸桿菌酶活性在37℃較高有關；而目的蛋白表達量隨著誘導時間先上升后趨于平穩，在5 h時達到最高，這說明長時間誘導并不能使蛋白表達量一直增高。

“Nε-賴氨酸乙酰化只能通過酶促或者非酶促兩個途徑完成，而去乙酰化則需要通過去乙酰化酶CObB來完成。迄今為止，大腸桿菌中已鑒定出的去乙酰化酶只有CobB一種，CobB是一種需要NAD+的參與才能調控乙酰化修飾的酶”［26-27］。本試驗采用大腸桿菌表達系統驗證PepA蛋白是否是去乙酰化蛋白以及去乙酰化CobB蛋白對目的蛋白的乙酰化調控程度。經研究得出CobB不能調控PepA蛋白的乙酰化修飾，說明PepA蛋白不是CobB反應的底物，這可能是賴氨酸上乙酰基團通過CobB以外的其它去乙酰化酶或其它去乙酰化方式移除［28］，此猜想還待未來印證。

4 結論

成功構建溶藻弧菌PepA重組表達菌株，其最優誘導表達條件為0.1% IPTG，37℃誘導5 h；經鑒定PepA蛋白是乙酰化蛋白，且在體外不存在去乙酰化。