Mangrovibacterium sp. SH-52耐熱內切型海藻酸裂解酶基因的克隆及酶學鑒定

李衛娜 申冬玲 張煜星 劉學通 伊日布斯

（1. 西京學院醫學院，西安 710000；2. 昆明理工大學生命科學與技術學院，昆明 650500）

海藻酸是一種線性多糖，由β-D甘露糖醛酸（M）和其C-5差異構體α-L古羅糖醛酸（G）通過1-4糖苷鍵連接而成的線性二元共聚物。根據兩種糖醛酸的排列，多糖鏈包含三種類型的內部結構：連續的polyM塊、連續的polyG塊和雜聚隨機排列的polyMG［1］。海藻酸是褐藻細胞壁的主要組成部分，占細胞壁干重的10%-45%。廣泛應用于食品、醫藥、化工和生物燃料等領域［2-4］。

目前，海藻酸降解的方法主要是物理降解法［5］、化學降解法［6］和酶解法［7］。相對比而言，酶解法具有偏好性高、無副產物且降解效率高等優勢，更適合海藻寡糖的制備［8］。海藻酸裂解酶通過β-消除機制催化海藻酸的降解，破壞單體之間的糖苷鍵，在糖環的C4和C5之間生成雙鍵［9］。海藻酸裂解酶是功能性低聚糖制劑的重要工具［10］，不與糧食競爭的生物轉化能源［11］。目前，已經從多種海洋生物、陸地細菌和一些病毒中發現海藻酸裂解酶［12］。根據反應模式和產物，可將海藻酸裂解酶分為外切型海藻酸裂解酶和內切型海藻酸裂解酶［13］。外切型海藻酸裂解酶降解海藻酸可以產生單糖，是海藻酸生產乙醇的先決條件［14-16］。內切型海藻酸裂解酶降解海藻酸主要產生二糖、三糖等寡糖，獲得的各種寡糖具有抗氧化、抗腫瘤、抗凝血、抗過敏活性、抗增值等生理活性［17-18］，在食品、生物化學和制藥等行業應用越來越廣泛［19］。在碳水-活性酶（Carbohydrate-Active enZYmes，CAZy）數據庫中，海藻酸裂解酶屬于多聚糖裂解酶類（Polysaccharide lyases，PL），根據催化模塊的相似性可以分為24個家族。大多數海藻酸裂解酶屬于PL-5、6、7、14、15、17和18家族。目前，PL-7海藻酸鹽裂解酶是所有分類海藻酸鹽裂解酶中最具代表性的，并在多個文獻中報道。已經在細菌中發現多個PL-7家族海藻酸裂解酶，如Streptomycessp.［20］，Agarivoranssp.［21］，Zobellia galactanivorans［13］，Saccharophagus degradans［22］。

盡管已經表征了大量的海藻酸裂解酶，但目前商業化利用的海藻酸裂解酶活性及特性仍有較大的提高空間。為了滿足一些極端的工業條件，關于特殊海藻酸裂解酶性質的研究越來越受關注，一些耐熱海藻酸裂解酶［23-24］，冷適應海藻酸裂解酶［21］，高堿海藻酸裂解酶［25］和耐鹽海藻酸裂解酶［26-27］已經被報道。因此，通過基因工程的手段對海藻酸裂解酶基因在大腸桿菌、酵母菌等工程菌中進行異源表達，表征新型海藻酸裂解酶，為尋求具有利用價值的海藻酸裂解酶奠定基礎。本研究從一株厭氧菌Mangrovibacteriumsp. SH-52中克隆一個耐熱內切型海藻酸裂解酶SHA-I，在大腸桿菌中表達后，進行純化，特性分析。結果表明該耐熱型海藻酸裂解酶是滿足極端工業應用的理想候選者。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和儀器 海藻酸鈉，Sigma；限制性內切酶、DNA聚合酶，日本寶生物工程有限公司；質粒提取試劑盒，北京百泰克生物科技有限公司；GST瓊脂糖凝膠親和層析柱，生工生物工程（上海）股份有限公司；標準品海藻酸二糖和三糖的制備參考Li等［28］的方法；PolyM和PolyG的制備參考Haug等［29］的方法；其余試劑均為國產分析純。PCR儀，Applied Biosystem公司；恒溫培養箱，上海一恒科技有限公司；超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物股份有限公司。

1.1.2 菌株和質粒 厭氧海藻酸分解菌Mangrovibacteriumsp. SH-52為本實驗室篩選保存；Escherichia coliJM109購自日本寶生物工程有限公司；Escherichia coliBL21購自北京轉基因生物技術有限公司。載體pMD19-T和pGEX-4T-1為本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離和鑒定 樣品采集自汕頭市汕頭港，在厭氧固體培養基（10 g NaCl，1.5 g K2HPO4，0.75 g KH2PO4，0.1g CaCl2，5 g（NH4）2SO4，0.1% Yeast extract，0.3% Tryptone，0.1% Trace element sol，0.75 g Cysteine，10 g Alginate和15 g瓊脂稀釋1 L蒸餾水中，pH 7.5，30℃）上進行稀釋和分離，之后將檢測到的菌落純化并接種到發酵培養基中（10 g NaCl，1.5 g K2HPO4，0.75 g KH2PO4，0.1 g CaCl2，5 g（NH4）2SO4，0.1% Yeast extract，0.3% Tryptone，0.1%Trace element sol，0.75 g Cysteine，10 g Alginate in 1 L of distilled water，pH 7.5，30℃）。

菌株SH-52的16S rRNA通過從全基因組PCR擴增獲得，利用16S rRNA基因通用引物擴增目的序列。引物16S Rrna-F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；16S rRNA-R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR反應體系（25 μL）：基因組DNA 2 μL，10× Taq Buffer 2.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2 μL，引 物16S rRNA-F 和16S rRNA-R 各0.5 μL，EasyTaq DNA polymerase（2.5 U/μL）0.3 μL，ddH2O 17.2 μL。PCR反應 條 件：94℃ 3 min，94℃ 45 s，52℃ 45 s，72℃1 min，30 個循 環，72℃，10 min；4℃保存。在GenBank數據庫中對SH-52的16S rRNA進行BLASTn比對搜索同源序列，選出同源性高的菌株的16S rRNA使用ClustalX進行序列比對，再用MEGA5利用Neighbor-Joining法構建系統進化樹。

1.2.2 海藻酸裂解酶SHA-I序列分析 通過Mangrovibacteriumsp. SH-52全基因組測序結果獲得海藻酸裂解酶SHA-I的氨基酸序列。信號肽使用SignalP 4.1進 行 預 測（http：//www.cbs.dtu.dk/services/）。理論分子量（Mw）和等電點（pI）的預算使用Compute pI/Mw工具（https：//web.expasy.org/compute_pi/）。在NCBI數據庫中對海藻酸裂解酶SHA-I的蛋白序列進行BLASTp比對搜索同源序列。

1.2.3 海藻酸裂解酶SHA-I的克隆、表達和純化 根據Mangrovibacteriumsp. SH-52海藻酸裂解酶SHA-I的基因序列和表達載體pGEX-4T-1的多克隆酶切位點設計一對特異性引物，SHA-I-F（BamH I）：5'-GGATCCATGAAAACCAATAA AATTCTGC-3'，SHA-I-R（NotI）：5'-GCGGCCGCTTAGTCATTCTT CGTGAAATAGC-3'。PCR反應體系（25 μL）：基因組DNA 2 μL，10× Taq Buffer 2.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2 μL，引物SHA-I-F和SHA-I-R各0.5 μL，EasyTaq DNA polymerase（2.5 U/μL）0.3 μL，ddH2O 17.2 μL。PCR反 應 條 件：94℃ 3 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30 個循環；72℃ 10 min，4℃保存。以Mangrovibacteriumsp. SH-52的基因組為模版進行擴增，PCR產物純化后連接到pMD19-T載體上，并熱擊轉化到Escherichia coliJM109中，克隆獲得的序列進行測序。海藻酸裂解酶SHA-I基因連接到含有BamH I和NotI酶切位點的表達載體pGEX-4T-1上。重組質粒pGEX-4T-1-SHA-I轉化到Escherichia coliBL21。篩選的陽性克隆子接種在液體LB培養基上，加入0.2 mmol/L的誘導劑IPTG（Isopropyl-β-D-thiogalactoside），28℃，100 r/min誘導12 h。細胞通過離心收集懸浮在Tris-HCl緩沖液中（20 mmol/L，pH 7.5；500 mmol/L NaCl），超聲破碎。用直徑為0.45 μm的濾膜過濾超聲破碎細胞的上清液，將此樣品使用epharose Resin 1 mL預裝重力柱進行純化。蛋白質濃度的測定使用BCA（Bicinchoninic acid）法，以牛血清蛋白作為標準。純化的SHA-I分子量使用SDS-PAGE（Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis）進行測定。

1.2.4 酶活性的測定 海藻酸裂解酶的活性通過在235 nm處的吸光度進行測定。測定方法：20 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH7.0），0.3%（W/V）海藻酸鈉，10 μg酶提取液，30℃保溫10 min，煮沸5 min終止反應。一個酶活單位的定義為：235 nm下吸光值每分鐘增加0.1所需的酶量。

1.2.5 酶特性分析 在SHA-I酶特性分析中以海藻酸作為底物。海藻酸裂解酶SHA-I最適pH的測定范圍為5.0-10.0，緩沖液為50 mmol/L的磷酸緩沖液（pH 5.0-7.5），50 mmol/L的Tris-HCl（pH 7.5-9.0），50 mmol/L的Gly-NaOH（pH 9.0-10.0）。最適溫度的測定范圍為20-90℃，以5℃為一個梯度。pH穩定性的測定，將酶液在pH 5.0-10.0緩沖液中4℃孵育1 h后，測定殘余的酶活力。熱穩定的測定，將酶液放置在20-90℃保溫1 h后，測定殘余的酶活力。為了分析不同金屬離子對SHA-I酶活性的影響，分別使用不同的金屬離子添加到反應混合液中測定酶活性。SHA-I的底物特異性通過以polyM，polyG和海藻酸為底物的酶活性進行測定。通過TLC（Thin layer chromatography）分析降解的產物，展開容積為1-正丁醇/乙酸/水（3∶2∶3，V∶V∶V），待展開完成，取出硅膠板吹干，在硅膠板表面噴灑10%的硫酸乙醇（顯色劑）溶液后放入110℃烘箱，加熱顯色。

2 結果

2.1 菌株SH-52的分離和鑒定

從汕頭市汕頭港采集樣品，通過分離獲得一株厭氧海藻酸分解菌SH-52。對菌株SH-52的16S rRNA進行PCR擴增。同源性比較發現該菌株SH-52與Mangrovibacterium marinumstrain FA423序列的相似性為99%。該菌與其近源菌株的16S rRNA序列構建系統進化樹（圖1）。初步鑒定其屬于紅樹林細菌屬（Mangrovibacteriumsp.），并命名為Mangrovibacteriumsp. SH-52。

2.2 SHA-I的序列分析

海藻酸裂解酶SHA-I基因全長1 089 bp，預測由362個氨基酸構成，分子量為40.45 kD，預測的等電點（pI）為4.73。海藻酸裂解酶SHA-I的核酸序列在GenBank上的登錄號為MT584798。SignalP 4.1預測表明，SHA-I沒有明顯的信號肽序列。BLASTp比對表明，海藻酸裂解酶SHA-I與Lewinella cohaerens的海藻酸裂解酶（WP_020539194.1）同源性最高，為80%，數據庫顯示Lewinella cohaerens的海藻酸裂解酶（WP_020539194.1）為PL7家族。

圖1 菌株SH-52的16S rRNA序列系統進化樹

SHA-I與其他已表征PL7家族海藻酸裂解酶氨基酸序列進行序列比對，如圖2所示。PL7家族海藻酸裂解酶有3個高度保守序列，SA3（RXEXR），SA4（YXKAGXYXQ）和SA5（QXH）。序 列 比 對表明SHA-I的3個高度保守序列為SA3（RTELA），SA4（FFKLGCYNQ）和SA5（QIH），其中僅有3個殘基不保守，分別為SA3中第5個堿基為A，SA4中第一個堿基為F，第4個堿基為L，其余殘基完全保守。另外，PL7家族海藻酸裂解酶有4個典型的催化殘基R、Q、H、Y，其中R在SA3的N末端區域，Q和H在L2上，Y在SA4的C末端，序列比對表明在SHA-I中有這4個典型的催化殘基R（Arg104）、Q（Gln148）、H（His150） 和Y（Tyr301）。SHA-I中PL7 表面活性裂縫殘基僅有兩個殘基不保守。但是，Sphingomonassp. A1-II’中覆蓋在活性裂縫上的兩個蓋環（L1和L2）在SHA-I中是不保守的。這些保守序列表明，SHA-I屬于PL7家族。

2.3 SHA-I的表達和純化

海藻酸裂解酶SHA-I基因直接從Mangrovibacteriumsp. SH-52的全基因組進行擴增，PCR產物連接到表達載體pGEX-4T-1中。在重組的蛋白表達載體中，一個GST標簽加到重組蛋白的C-末端。重組的SHA-I使用GST-Sepharose Resin 1mL預裝重力柱進行純化。SDS-PAGE分析表明，融合蛋白分子量大小約為67 kD，其中GST融合標簽為26 kD，故SHA-I蛋白分子量為41 kD，接近預測的理論分子量（40.45 kD）（圖3）。酶活性分析表明，純化前的蛋白濃度為162 mg/L，純化后剩余3.2 mg/L。純化后蛋白酶活達到13 U/mg，而未純化的粗蛋白酶活僅為2.6 U/mg，純化后酶活提高5倍（表1）。

2.4 海藻酸裂解酶SHA-I的特性分析

SHA-I在酸性和堿性條件下酶活性都不高，最適pH為7.0（圖4-A），在pH 6.0-9.0之間比較穩定（圖4-B）。SHA-I最適溫度是50℃，在60℃時的活性接近最高活性的60%，在80℃時約為最高活性的40%（圖4-C）。在50℃孵育1 h后，SHA-I保留大約起始活性的40%（圖4-D）。表明SHA-I是一個耐熱海藻酸裂解酶。

圖2 SHA-I與PL7家族氨基酸序列的比對

金屬離子對SHA-I活性的影響結果如表2所示。加入1 mmol/L NaCl時，海藻酸裂解酶SHA-I的酶活沒有明顯增加，加入50 mmol/L NaCl 時酶活增加了56%，加入100 mmol/L NaCl 時酶活增加了58%，再增加NaCl濃度已不能提高酶活。EDTA對酶活有強烈的抑制作用。除了Ni2+和Hg2+，大多數金屬離子對酶活沒有很大的影響。

圖3 SDS-PAGE檢測重組酶SHA-I的純化

使用polyM、polyG和海藻酸鈉為底物測定SHA-I的底物特異性，SHA-I對polyM和polyG都有活性，但對polyG的活性比polyM高將近2.5倍（圖5-A），表明SHA-I更偏好于polyG。TLC分析表明，SHA-I降解海藻酸鈉主要產生二聚體和三聚體，還有一些四聚體和更大的寡糖，不能產生單糖（圖5-B），表明SHA-I為內切型海藻酸裂解酶。

表1 重組海藻酸裂解酶SHA-I的純化

圖4 pH和溫度對SHA-I酶活性和穩定性的影響

3 討論

本實驗室篩選的厭氧海藻酸分解菌，系統進化分析其與Mangrovibacterium marinumstrain FA423親緣關系最近，兩菌株16S rRNA基因序列相似度為99%，故命名為Mangrovibacteriumsp. SH-52。與好氧菌相比，厭氧菌底物轉化效率高，可直接發酵底物產生乙醇，因此篩選厭氧海藻酸分解菌對生物質轉化的研究提供了一種更好的方案。

表2 金屬離子對重組酶SHA-I活性的影響

圖5 SHA-I底物特異性和降解產物的TLC分析

海藻酸裂解酶SHA-I屬于PL7家族。序列比對表明SHA-I有PL7家族海藻酸裂解酶的3個高度保守序列SA3（RTELA），SA4（FFKLGCYNQ）和SA5（QIH），僅3個殘基不保守，這3個保守序列構成了活性中心，是底物識別和催化的關鍵［13，30-31］。另外，SHA-I中有PL7家族海藻酸裂解酶的4個典型殘基R、Q、H、Y，這4個殘基構成其活性位點，其保守性和適當的位置是酶水解活性的先決條件［33］。但是，Sphingomonassp. A1-II’中覆蓋在活性裂縫上的兩個蓋環（L1和L2）在SHA-I中是不保守的，這兩個環的靈活性對底物與酶活性間隙的結合有重要的作用［31］。

對海藻酸裂解酶SHA-I的酶學性質進行研究表明，SHA-I是一個耐熱海藻酸裂解酶。SHA-I最適溫度是50℃，在60℃時的活性接近最高活性的60%，在80℃時約為最高活性的40%，在50℃孵育1 h后，SHA-I保留大約起始活性的40%。大多數海藻酸裂解酶最適溫度較低或溫度耐受性差。如來自Sphingomonassp. MJ-3的海藻酸裂解酶MJ-3在50℃時酶活性最高，但在60℃和70℃時僅分別是最高活性的10%和5%［34］。目前耐熱海藻酸裂解酶已有報道，但研究的較少。Yang等［24］對兩個耐熱型海藻酸裂解酶oalY1和oalY2進行了特征分析，分別在45℃和50℃時酶活性最高，在60℃時約為最高酶活的50%，80℃時約為最高活性的20%。Inoue等［23］對來自Nitratiruptorsp. SB155-2的耐熱海藻酸裂解酶NitAly進行了特征分析，其最適溫度為70℃，67℃孵育30 min后損失50%的酶活，該酶是目前發現耐受溫度最高的海藻酸裂解酶。海藻酸降解產生寡糖具有廣泛的應用價值，降解方法包括物理降解法、化學降解法和生物降解法。隨著科學技術的不斷革新，各學科之間的不斷交融，相信在后期的發展過程中會逐步開發更環保、更合理、更高效的降解方法。篩選耐熱型海藻酸裂解酶可以與熱解法相搭配以期能更高效的降解海藻酸產生寡糖。

金屬離子對SHA-I的酶活影響表明，加入1 mmol/L NaCl時，海藻酸裂解酶SHA-I的酶活沒有明顯增加，加入50 mmol/L NaCl 時酶活增加了56%，加入100 mmol/L NaCl 時酶活增加了58%，再增加NaCl濃度已不能提高酶活。EDTA對酶活有強烈的抑制作用。除了Ni2+和Hg2+，大多數金屬離子對酶活沒有很大的影響。對于很多海藻酸裂解酶來說，NaCl可以顯著地促進酶活，來自Pseudoalteromonassp. CY24 的 AlyPI，添加100 mmol/L NaCl可以使酶活提高到180%［35］。重金屬離子Ni2+、Hg2+、Co2+、Mn2+等可以使蛋白質變性，對海藻酸裂解酶有較強的抑制作用，但不是所有的海藻酸裂解酶都受它們的抑制，如Mn2+可以促進Pseudoalteromonassp.SM0524中AlyPM的活性［36］。EDTA可以螯合溶液中的金屬離子，強烈的抑制酶的活性，Aspergillus oryzae的海藻酸裂解酶在EDTA存在時，酶活降為原來的15%［37］。

研究SHA-I的底物偏好性發現該酶對polyG的活性比polyM高將近2.5倍，表明SHA-I更偏好于polyG。有學者對PL7家族海藻酸裂解酶結構與底物特異性的關系進行了研究，該家族海藻酸裂解酶底物特異性由高度保守序列SA5（QXH）決定，如果海藻酸裂解酶的保守序列為QVH，可特異性降解polyM，如果保守序列QIH，則可特異性降解polyG和polyMG［9，38］。SHA-I的高度保守序列為QIH，對polyG具有偏好性，與研究相符。TLC分析表明，SHA-I降解海藻酸鈉主要產生二聚體和三聚體，還有一些四聚體和更大的寡糖，不能產生單糖，表明SHA-I為內切型海藻酸裂解酶。后續我們將進一步研究不同類型海藻酸裂解酶對海藻酸的降解特性及其協同作用，并深入了解其酶學機理和綜合應用，開發具有工業化應用價值的海藻酸裂解酶。

4 結論

本研究獲得的海藻酸裂解酶SHA-I屬于PL7家族，是一個對polyG有底物偏好性的耐熱內切型海藻酸裂解酶，其耐熱型是海藻酸工業應用中好的候選者。