β-果糖苷酶抑制子的研究進展

周懷燁 周碧瑤 蘇濤

（南京林業大學南方現代林業協同創新中心 南京林業大學生物與環境學院，南京 210037）

高等植物中，源組織是光合同化物的凈生產者，庫組織是光合同化物的凈輸入者［1-2］。蔗糖是碳同化產物的初級形式，經篩管復合體從源組織轉運至庫組織［2］。蔗糖從韌皮部卸載到庫細胞中后，通過胞間連絲被細胞內轉運途徑吸收，參與代謝和合成過程［3］，或通過蔗糖轉運蛋白（Sucrose transporters）輸出到質外體，用于真菌拓殖或是防御相關的響應［3-4］。植物可直接利用的糖大多為單糖，蔗糖需水解才能被植物所利用［5］。蔗糖能夠被兩種酶水解：一種是蔗糖合成酶（Sucrose synthase，EC2.4.1.13，Susy），將蔗糖和尿苷二磷酸（Uridine diphosphate，UDP）催化轉化為底物UDP-葡萄糖和果糖；另一種是蔗糖轉化酶（Invertase，EC3.2.1.26，INV），催化蔗糖裂解為葡萄糖和果糖（已糖）［6］。由于Susy的催化反應是可逆的，而INV催化裂解蔗糖是不可逆的。因此，INV在碳的利用和分配中的作用更關鍵［5］。糖不僅是植物必需的營養物質，也是調控基因表達的關鍵信號分子。INV通過影響碳源分配和糖信號功能，在穩定植物的源-庫平衡，調節生長發育和脅迫適應等方面具有重要作用［7-9］。

根據蛋白質的可溶解度、最適pH值、亞細胞定位和等電點等特性，INV分為中性/堿性胞質類蔗糖轉化酶（Cytosolic invertase，CI）和酸性蔗糖轉化酶（Acid invertase，AI）［10］。CI是一類非糖基化的蛋白，催化活性的最適pH為6.8-9.0，通常靶向定位在細胞質、線粒體、質體和細胞核，僅特異性作用于蔗糖。AI催化活性的最適pH為4.5-5.5，是糖基化酶，由細胞壁蔗糖轉化酶（Cell wall invertase，CWI）和液泡蔗糖轉化酶（Vacuolar invertase，VI）構成，VI是可溶性的，CWI是不可溶的。除了水解底物蔗糖，AI還能水解含有β-果糖的其他低聚糖（如棉籽糖和水蘇糖），因此又稱之為β-果糖苷酶（β-fructosidase）［5，11］。研究表明CWI參與質外體蔗糖的分配，影響庫器官的強度，糖信號轉導和環境刺激反應［3，9，12-18］，而VI主要調節滲透壓影響細胞的伸長和擴大［6，19-23］。

早期的研究認為，AI主要受其編碼基因在轉錄和轉錄后水平的調控。然而，由于AI蛋白具有穩定結構的糖基化修飾，因此，其活性在很大程度上依靠翻譯后調控機制［24］。近年來，研究發現這種調控機制主要由一類小分子量（14-23 kD）的抑制蛋白介導。該蛋白靶向定位在質外體或液泡中，能夠特異性的抑制CWI或VI，稱為β-果糖苷酶抑制子（Cell wall/Vacuolar Inhibitor of β-fructosidases，C/VIFs）。根據近些年的研究報道，本文綜述了C/VIF的分子結構和生化特點，編碼基因在器官和組織的時空表達特征，在植物發育中的生理學功能以及該框架下的調控機制。

1 C/VIF的理化性質、分子結構和時空表達特征

1.1 C/VIF生化特征和蛋白保守結構

從1994年Pressey和Weil分別報道用柱層析法從番茄果實和煙草懸浮培養細胞中分離出C/VIF蛋白酶，到1998年德國的科學家Greiner首次在煙草中克隆出了Nt-inhl的cDNA，并驗證其異體表達的純化蛋白對AI的體外抑制活性［25-27］，這些實驗為開啟C/VIF蛋白酶的生化特性研究奠定了基礎。眾多的體內和體外實驗揭示C/VIF蛋白主要有以下特征：（1）蛋白分子質量約14-23 kD，具有熱穩定性，其氨基酸序列中度保守，在種間和種內變異較大，如煙草的CIF和VIF的蛋白序列同源性只有47%。因此，僅從序列上很難預測蛋白的靶向功能［11］。（2）對煙草NtCIF的蛋白結構模擬和結晶法解析發現，其蛋白結構中有4個不對稱的α螺旋，這種特征可維持NtCIF單體（Monomer）結構的完整性，同時也是AI結合的重要區域。此外，4個半胱氨酸（Cysteine，Cys）保守位點，可在分子內形成兩個二硫鍵，利于穩定蛋白結構。因此，在還原劑二硫蘇糖醇（Dithiothreitol，DTT）作用下，NtCIF蛋白在凝膠電泳上會有位移現象發生［28］。（3）C/VIF的抑制功能是通過插入AI和底物蔗糖的催化位點之間的裂口，形成復合物來發揮其功能性抑制（圖1）。C/VIF這種對AI水解活性的抑制活性會依賴于溶液中的pH值、蔗糖和二價金屬離子（如Ca2+、Mg2+和Zn2+等）濃度的改變［26］（圖1）。

1.2 C/VIF在不同器官和發育階段的特異性表達

對基因時空表達模式進行分析可為基因的生理功能和體內活性的研究提供重要線索。熒光定量PCR比較C/VIF編碼基因在兩個甘蔗品種GT28和ROC22莖中的表達差異，結果顯示SoInvInh2基因表達量在GT28 中高于ROC22，而CWI在GT28 中的酶活性顯著低于ROC22。相關性分析表明該基因表達量與CWI活性呈顯著負相關，說明SoInvInh2可能是直接抑制甘蔗莖中CWI活性，改變蔗糖的合成和分解［29］。在澳洲甘蔗莖節間發育和成熟過程中，C/VIF編碼基因ShINH1的表達會逐漸顯著降低；同時，ShINH1在源葉中的相對表達高于庫組織（莖、花和根）［30］。研究發現不同年限鐵皮石斛的莖CWI活性與DoInvInh1和3的表達模式負相關，這種相關性隨著莖齡的增加更加顯著，說明DoInvInh1和3可能調節鐵皮石斛莖中的CWI活性，影響多糖的合成前體蔗糖的代謝［31］。

番茄中SolyCIF在花器官中高表達，與紅色果實相比，SolyCIF在綠果中的轉錄水平更高［32］。在大豆中，GmCIF1的轉錄本在花和種子發育初期具有高表達特征［24］。同樣，煙草Nt-inh1的RNA印跡分析表明15周齡煙草的花瓣、子房和雄蕊等性器官中轉錄水平較高［27］。最新的研究表明，木薯的IbINH轉錄本在貯藏根中最高，在葉片中的表達最低［33］。然而，在衰老的條件下，煙草Nt-inh1和CWI轉錄水平的共表達模式會呈下降趨勢［27］。因此，不同植物或作物的C/VIF表達模式表明，C/VIF可能在庫組織（根、莖和性器官等）轉錄水平會高一些，在源組織中的轉錄水平較低，這可能是由于庫組織的蔗糖卸載和轉運到胞內需要相對較高的AI活性。但是在脅迫條件下，CIF在源葉中會有高度響應。此外，C/VIF在相同器官（如果實和種子）不同發育階段會隨著器官的成熟降低轉錄本量，說明C/VIF極有可能只參與初期器官的發育的形態建成。

圖1 影響C/VIF表達的因素以及C/VIF在植物中的功能

1.3 C/VIF對細胞內/外因子的響應

C/VIF基因表達會受到外界不同環境因子和植物激素因子的調節（圖1）。在煙草懸浮細胞中，外加脫落酸（Abscisic acid，ABA）可以顯著誘導NtCIF轉錄本量和蛋白質表達［11］。同樣，在擬南芥和大豆葉片中，AtCIF1和GmC/VIF1的表達會對ABA濃度的增加呈現線性響應趨勢，說明了C/VIF可能參與ABA誘導衰老的主要組分［24，34］。最新報道顯示，楊樹根特異表達的PtC/VIF2受ABA處理的誘導［10］。此外，木薯中IbINH的轉錄本受干旱脅迫和ABA、水楊酸（Salicylic acid，SA）和茉莉酸（Jasmonic acid，JA）等激素的誘導［33］。對康乃馨進行放線菌酮處理，蔗糖從衰老花瓣向鄰近器官（如花托和子房）的轉移減少［35］。這可能是因為C/VIF阻止蔗糖水解，利于蔗糖裝載到韌皮部進行碳的再動員，使枯萎花瓣向鄰近器官轉移碳水化合物。有意思的是，有研究發現一個疑似C/VIF的編碼基因的轉錄本可以被ABA抑制，推測ABA影響AI的活性是通過調控C/VIF的表達實現的［36］。

C/VIF的表達還受到環境脅迫因子低溫和干旱以及傷脅迫的調節和誘導［10，37-39］。在生物脅迫因子中，假單胞菌（Pseudomonas syringaepv. tomato DC3000）侵染擬南芥源葉后，發現AtC/VIF2表達量在24 h和48 h顯著下調，而CWI的活性成相反趨勢［38］。同樣，在灰霉病菌（Botrytis cinerea）侵染擬南芥后，AtC/VIF2的轉錄本表達受到抑制，而AtCWIN1基因表達量被誘導增加［39］。木本毛果楊根部在病原真菌腐皮鐮刀真菌（Fusarium solani）處理之后，PtC/VIF1和PtC/VIF2的轉錄水平同時下降［10］。這些實驗表明C/VIF可能通過抑制AI活性，直接或間接參與蔗糖介導的防御和免疫途徑。

馬鈴薯中研究發現C/VIF對AI的抑制受制于信號分子蔗糖非酵解型蛋白激酶（Sucrose non-fermen-ting1-related protein kinase，SnRK）的調控（圖1）。雙分子熒光互補實驗表明馬鈴薯的StvacINV1、StInvInh2B與SbSnRK兩兩相互作用形成蛋白復合物。體外激酶分析和蛋白磷酸化分析顯示，SbSnRK1α和β亞基在StInvInh2與StvacINV1的結合過程中起關鍵發卡作用［40］。有趣的是，C/VIF還能與果聚糖外切水解酶（Fructan exohydrolases，FEHs）形成復合體，FEH有可能通過與C/VIF競爭性結合來微調CWI活性［41］。此外，熱激蛋白基因SlHSP17.7在番茄SlCIF1過表達植株中的轉錄本高度上調，深入研究發現，抑制SlHSP17.7表達顯著降低己糖的含量，說明SlHSP17.7可以通過互作SlCIF1來改變番茄果實中的糖代謝過程［42］。

2 C/VIF在植物中的功能性研究

2.1 調控種子、果實的發育和衰老

人口膨脹使人們已經意識到糧食危機和尋求策略提高作物產率的重要性，因此，增加植物源葉中光合產物糖的輸出，同時加強這些糖在庫組織中的卸載和存儲容量（Storage capacity）是植物生長和產量最大化的潛在手段［1］。在庫組織中，CWI是蔗糖卸載的關鍵酶，大量研究證明，CWI通過調節糖代謝和信號作用，促進花器官分化種子和果實的發育［13-14，43-44］。而在庫器官成熟過程中，C/VIF作為介導CWI翻譯后調控的機制，調節質外體空間蔗糖水解產物容量和信號功能對植物的庫器官發育有著重要影響（圖1）。

研究發現，在果實特異性表達啟動子2A11的作用下，激活番茄內源β-果糖苷酶抑制子SlCIF1的高效表達顯著抑制果實中CWI活性并導致花期提前，番茄果實的發育和品質也發生改變［42］。番茄中的質外體INVINH1被發現可以和LIN5（CWI）發生靶向特異性結合。在INVINH1的RNAi植株中，CWI活性和己糖水平被提高，種子和果實變得更飽滿；同時發現，在ABA處理條件下，RNAi植株葉片衰老過程被延遲，說明INVINH1和LIN5的互作和共表達可能誘導葡萄糖的信號功能，在子房-果實的器官轉換中起到核心作用［45-46］。ABA是誘導某些植物葉片衰老的關鍵激素［46］。同樣，抑制大豆中的GmCIF1表達顯著增加了種子的飽滿度，種子中的淀粉、可溶性糖和蛋白增加，說明種子成熟過程中淀粉和蛋白質的合成需要沉默GmCIF1，促進蔗糖卸載，釋放更多的已糖［24］。淀粉是種子發育過程中碳水化合物的主要儲存形式，種子萌發后，淀粉降解為可溶性糖，為細胞呼吸提供養料，為幼苗生長提供能量［47］。對擬南芥AtCIF1的功能缺失突變體cif11的免疫和代謝產物分析發現，CWI活性在種子萌發早期顯著上升，已糖含量提高，一些糖轉運蛋白基因表達也受到不同程度的誘導升高。在ABA作用下，cif11種子萌發率和野生型相比顯著升高。這些證據表明AtCIF1對CWI活性的翻譯后調控能夠微調蔗糖水解，可能通過產生糖信號功能影響種子萌發和早期幼苗的生長［34］。

研究人員發現番茄中VIF調節VI活性同樣也能夠影響果實的顏色和口味等質量性狀及成熟過程（圖1）。調控果實成熟過程主要由一個RIN蛋白調控SlVIF的表達，抑制SlVI的活性，導致色素和乙烯的合成的改變。與野生型果實相比，SlVIF過表達的番茄株系果實成熟較快，開花后35 d的果實中乙烯產量檢測增加了60%［48］。該機制的發現對提高果實質量具有重要農業價值。此外，VIF還與果實的儲藏和保鮮相關。最新研究發現在梨中，蔗糖主要分布在液泡中，果實貯藏過程中蔗糖豐度的變化與VI活性的變化有關。其中VI編碼基因（PbrAc-Inv1）的體內功能檢測發現可加速液泡中蔗糖水解，而一個VIF（PbrII5）可與PbrAc-Inv1結合形成失活復合物，下調VI活性，抑制蔗糖分解［49］。然而，作者并沒有對VIF和VI互作機制做更深入的研究。

2.2 抑制低溫誘導糖化

馬鈴薯在低溫儲存條件下，會導致塊莖中還原糖的積累，導致淀粉降解，甜度增加，這種現象叫做低溫誘導糖化［50］。塊莖中還原糖的增加對加工質量和品質有負面影響，因為在油炸過程中還原糖會與游離氨基酸發生反應，產生對人體有毒害的丙烯酰胺，影響口感和顏色以及健康［51］。因此，預防還原糖在馬鈴薯塊莖中的累積對馬鈴薯加工業具有重要的經濟意義。冷糖化過程中還原糖的積累是多種代謝途徑相互作用的結果，其中VI催化的蔗糖代謝途徑尤為突出。因此，推測通過改變VI酶活可以直接抑制低溫誘導糖化現象的發生［51］。因VIF在翻譯后調控VI活性，早期的研究發現，在馬鈴薯中異體表達煙草NtVIF基因可以顯著抑制VI的活性，降低塊莖的低溫誘導糖化現象［51］，說明調控VIF具有生物工程意義。目前越來越多的實驗，通過利用VIF的翻譯后調控機制抑制VI水解活性，即通過過表達特異性VIF蛋白的編碼基因，微調蔗糖水解產物，可以顯著地減少了還原糖的合成，抑制了冷糖化（圖1），提高馬鈴薯的加工質量［51-52］。

2.3 抗逆適應性

植物在自然環境中常常面臨著不同的環境因子（干旱、低溫和鹽脅迫等），會利用多種分子調控機制改變抗逆適應性用以生存。CWI的活性是多種逆境脅迫因子的信號蛋白，因此，CIF介導對CWI翻譯后調控機制可能廣泛地參與多種抗逆響應和防御過程［16］（圖1）。

在甘薯中過表達β-果糖苷酶抑制子IbINH發現植株生長減慢，然而在干旱條件下植株的抗旱性增強。抑制IbINH表達，植株呈現相反的發育性狀和抗旱表現。對葉片中糖的代謝產物測定發現，蔗糖和己糖含量顯著改變，ABA生物合成基因和非生物脅迫響應相關基因在抗旱的轉基因植株中均顯著上調［33］。這些結果表明IbINH通過誘導源-庫強度和ABA調節途徑來介導甘薯的生長和抗旱性。

在低溫條件下，番茄中沉默INVINH1的表達，CWI活性升高，耐寒性增強；而過表達INVINH1的轉基因番茄植株則與之相反，CWI活性降低，耐寒性減弱。同時，ABA合成基因表達顯著上調，但ABA信號基因無明顯變化，表明INVINH1通過影響ABA的合成調控番茄對低溫脅迫的應答［37］。最新研究發現，通過改變AtCIF1在擬南芥的表達，轉基因植株對ABA的敏感性和耐鹽性被顯著改變，說明通過CIF調控CWI活性變化和ABA響應和耐鹽性相關［53］。在氣孔開度的機制上，VIF能通過調控VI活性調節氣孔開度，以提高植物抗旱性。該機制通過發現擬南芥保衛細胞中VI活性明顯高于其他葉表皮細胞，其水解活性可以改變液泡中蔗糖-己糖梯度，引起保衛細胞中的水勢變化，調節氣孔開度，影響植物的耐旱性［54］。同樣，在擬南芥中異源表達煙草NtVIF基因得到的轉基因植株，在干旱條件下耐旱性提高，同時伴隨著VI活性、氣孔導度和電導率下降［55］。

CWI水解蔗糖產生的已糖一方面被質外體的病原微生物吸收用于侵染定殖，另一方面在植物宿主中作為信號分子引發葉片或根組織防御響應和糖免疫過程的發生，如病程相關蛋白基因的誘導，光合作用的下調，以及細胞壁加厚和胼胝體的形成等。就生物脅迫而言，目前已經在多種植物中發現，病原侵染植物宿主會直接誘導CWI的表達和活性提高［56-66］，而CWI活性的變化可能和CIF的表達（或活性）直接相關。研究人員推斷C/VIF可能通過在質外體中調控CWI活性微調糖穩態間接影響植物對病原微生物的防御過程。通過改變C/VIF的表達影響植物對病原脅迫的抗性和干擾病原微生物的侵染研究目前僅在擬南芥中有少量報道。在假單胞菌侵染擬南芥源葉之后，CWI活性顯著增加，AtC/VIF2的表達被抑制，這表明CIF表達變化可能是植物宿主主動產生病原菌防御反應的總要因素［38］。有趣的是，擬南芥根腫病成因發現是由病原真菌P.brassicae感染引起，通過轉基因手段提高AtCIF1和AtC/VIF2在擬南芥根部的表達，植株的CWI活性顯著降低，對病原真菌的感染指數降低，根瘤癥狀明顯減輕［67］。該研究間接證明CIF調控CWI的活性和植物的抗逆和防御響應高度相關。然而，CIF的病原防御的生理功能和潛力依然有待研究。

3 展望

AI是一類具有信號肽的分泌蛋白，且含有穩定結構的糖基化修飾，加上越來越多的實驗發現AI編碼基因的表達和活性變化并不一致。因此，AI酶的活性調控在很大程度上依賴于蛋白水平的調節，而這種翻譯后調節機制便由小分子蛋白C/VIF介導。通過抑制或增加C/VIF編碼基因表達，能夠改變AI水解底物蔗糖活性，微調碳素分配，并發揮水解產物己糖的信號功能。雖然C/VIF微調AI活性在穩定植物的源-庫代謝平衡，促進生長發育和抗逆適應以及防御響應等方面所具有的重要生理作用，已經在模式植物擬南芥和作物中被廣泛報道，目前仍有一些問題需要深入解析。首先C/VIF與果膠甲酯酶抑制子（Pectin methylesterase inhibitors，PMEI）在進化上高度同源，都含有氨基酸序列保守區（4個Cys）和幾乎相同的蛋白分子量，但在成熟蛋白結構和靶向功能上完全不同。雖然體外研究發現，改變一個氨基酸殘基可以互換C/VIF和PMEI的靶向抑制特異性，但除了重組蛋白的純化和活性研究，仍然缺乏在序列上有效的方法區分C/VIF和PMEI的體內或體外底物抑制活性。此外，已有報道揭示C/VIF的生理功能和防御微生物脅迫相關，然而，該領域的研究仍然缺少證據揭示何種因子（宿主或微生物），能夠誘導C/VIF轉錄本（或蛋白）變化來改變質外體環境或液泡中的糖穩態，參與防御和免疫過程。目前已有大量的報道揭示C/VIF的生理學重要性，但是木本植物中C/VIF的編碼基因和其潛在的功能性研究仍然缺乏，尤其是C/VIF在木本植物微調糖穩態和信號功能對植物生長和發育以及抗逆適應性研究依然是空白。因此，這些問題都有待進一步研究，本綜述將為上述熱點問題的揭示提供研究方向和理論依據。2013.