萜類化合物在釀酒酵母中的合成生物學研究進展

李佳秀 蔡倩茹 吳杰群

（浙江工業大學綠色制藥協同創新中心，杭州 310014）

萜類化合物（Terpenoids）是自然界中普遍存在的最大類的天然產物，目前已鑒定得到的種類超過55 000多個，占所有天然化合物的60%［1］。萜類化合物多樣性豐富，具有廣泛的生物學功能，作為代謝產物在細胞層面影響其組成和能量供應，作為激素等媒介因子影響生物體之間的拮抗和互生共生關系［2］。萜類化合物可以保護多種植物、動物和微生物免受捕食者、病原體和競爭者的攻擊，并參與生物種群中關于食物、配偶和敵人的信息傳達［3］。在過去幾十年中，由于其多樣的生物活性和極高的生物利用價值，萜類化合物已被廣泛用于醫藥和工業應用領域，市場需求巨大［4-5］。

目前，萜類化合物有以下3種生產方式：傳統提取法、化學合成法以及微生物合成法。由于大多數產業應用規模化的萜類化合物為次級代謝產物，含量較低且分離過程復雜，從天然原料中提取的萜類化合物的產量難以滿足市場需求，且會消耗大量生物資源，對生態環境造成不可逆的影響［6］。例如，人參干燥根中人參皂苷的含量僅為其干重的0.01%［7］。提取1 kg的紫杉醇需要砍伐數千株成熟紅豆杉，為提供一個癌癥病人所需的治療劑量需要犧牲2-4株成年樹［8］。同時，由于萜類化合物本身結構復雜，通過化學方法全合成復雜萜類化合物的路線繁瑣，反應條件、原料較為苛刻，得率極低，同樣不能滿足工業生產需要。例如，紫杉醇的全合成需要35-51個步驟，最高產率僅0.4%［9］。微生物發酵生產萜類化合物具有成本低廉、綠色環保、生產效率高等優勢，近年來合成生物學的興起也使真核來源的復雜萜類化合物的微生物合成得以實現。

合成生物學是一門綜合學科，它將工程方法與化學、生物學、數學和物理學等基礎科學方法相結合［10］，在非自然化學系統中重現了生命系統遺傳和進化的特性［11］。依托合成生物學技術平臺，科學家們在復雜萜類化合物來源生物（微生物、植物和真菌）中收集與其生化途徑相關編碼酶的基因，對其修飾和改良后引入經工程改造、適合生產的底盤細胞中，從而實現高價值萜類化合物的生物合成［6］。抗瘧疾藥物青蒿素前體青蒿酸在釀酒酵母中的高效異源表達就是合成生物學研究的標志性成果［12-13］。目前，通過合成生物學與后續化學修飾工藝耦合，青蒿素的工業生產成本已與植物提取相當。自此，關于微生物合成復雜萜類化合物研究的創新成果層出不窮。人參皂苷Rh2來源于人參屬植物，是一種癌癥預防及治療的候選藥物。Wang等［7］通過模塊化工程設計優化了甲羥戊酸途徑以及人參皂苷P450酶的表達水平，構建了高產人參皂苷糖苷配糖原二醇（Protopanaxadiol，PPD）的底盤細胞，從而提高了人參皂苷Rh2的產量（10 L發酵罐分批補料發酵產量為2.25 g/L）。青蒿素和人參皂苷僅是數以千計潛在的高價值萜類化合物中的兩種，合成生物學方法為合成多元化高價值萜類化合物提供了可持續的生產途徑，并為新化合物的發現開辟了新的可能性。

釀酒酵母由于其遺傳操作便捷、培養成本低、抗噬菌體感染、具有真核表達修飾系統等特點，被廣泛用于生產各種小分子和大分子化合物，是許多生物過程的首選底盤細胞［14-15］。近年來，基因合成成本大幅降低［16］，基因編輯技術不斷革新（如CRISPR/Cas系統的應用［17］），合成生物學在生物技術工業中的應用正在加速發展［18-19］。越來越多基于釀酒酵母底盤細胞的合成生物學策略應用于高價值萜類化合物的生物合成。因此，本文將從優化異戊二烯前體途徑酶、改造中央碳代謝、平衡競爭途徑、異源表達細胞色素P450酶4個方面闡述在釀酒酵母底盤細胞中高價值萜類化合物的合成生物學的最新策略與進展。

1 優化異戊二烯前體途徑相關酶

萜類化合物定義為以2-甲基丁-1，3-二烯（又名異戊二烯，Isoprene）碳骨架為基本單元的碳氫化合物及其衍生物，其起源于前體物質異戊烯基焦磷酸（Isopentenyl diphosphate，IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（Dimethylallyl diphosphate，DMAPP）［20］。IPP和DMAPP在不同生物體內涉及兩種不同的途徑：在大多數原核生物和植物細胞質體中，這些化合物通過甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸（2-C-methyl-Derythritol 4-phosphate，MEP）途徑產生（圖1-A），而在大多數真核生物、古細菌和某些原核生物（具有核心類異戊二烯途徑模塊）中，其通過甲羥戊酸（Mevalonate，MVA）途徑產生（圖1-B）［21］。

前體在代謝工程中是一個關鍵的限制因素，增加異戊二烯的前體供應可以提高萜類化合物的產量。基于釀酒酵母內源的甲羥戊酸途徑，增加前體DMAPP和IPP供應的傳統策略是優化MVA途徑相關酶（圖1-B）［22］。早期研究表明，MVA途徑中大多數結構基因（ERG10、ERG13、HMGR、ERG12、ERG8、IDI1和ERG20）的過度表達，都可以增加萜類化合物的產量［23］。此外，HMG1的N端截短版本（tHMG1）的過表達可催化其蛋白C端定位于細胞質，從而解除法尼基焦磷酸（Farnesyl pyrophosphate，FPP）的反饋抑制，可顯著增加角鯊烯的生產［24-25］。這種截短修飾被廣泛應用于萜類化合物的生產，例如檀香烯的生產［26］。組合設計是求解復雜代謝途徑最優解的有效策略。Song等［27］結合啟動子、整合拷貝數、染色體整合位點等因素，對于MVA途徑關鍵酶進行組合洗牌優化，可使香葉基香葉醇的產量提高至1 315.44 mg/L。

除了內源的MVA途徑，也有研究將異源的異戊二烯前體途徑引入釀酒酵母基因組中［28］。由于NADH需要氧氣氧化來維持氧化還原狀態，而MEP途徑不會產生額外的NADH，因此導入異源MEP途徑相關酶（DXS、IspC～H等基因）的工程酵母能夠在低曝氣條件下僅依靠MEP途徑而不是MVA途徑來合成萜類化合物（圖1-A）［29］。將帶有線粒體靶向信號序列的MVA途徑基因整合到釀酒酵母基因組中，構建得到具有天然的胞質MVA途徑和工程的外源線粒體MVA途徑的釀酒酵母底盤細胞，其可以同時利用胞質和線粒體乙酰輔酶A，可使工程酵母中異戊二烯的產量提升至2.5 g/L（圖1-C）［30］。

圖1 萜類化合物的生物合成的前體途徑優化策略

2 提高乙酰輔酶A利用率的中心碳代謝研究進展

在酵母中，乙酰輔酶A（Acetyl-CoA）連接了中心碳代謝與甲羥戊酸途徑，是萜類化合物合成的重要代謝節點。酵母中的乙酰輔酶A合成途徑較為復雜，主要分為兩個部分：細胞質中的乙酰輔酶A通過糖的分解代謝生成，其中涉及的酶為PDH旁路中的乙醛脫氫酶（ALD6）、乙酰輔酶A合成酶（ACS）及丙酮酸脫氫酶（PDC）；線粒體中的乙酰輔酶A通過丙酮酸脫氫酶復合體（PDHC）產生，該途徑為細胞內乙酰輔酶A的主要合成途徑。不同細胞器間生成的乙酰輔酶A沒有直接轉運［31］。針對PDH旁路，過量表達乙醛脫氫酶（ALD6）、乙酰輔酶A合成酶（ACS）以及丙酮酸脫羧酶（PDC）是在酵母中增加乙酰輔酶A供應的傳統策略（圖2-A），通過此策略可顯著提高紫穗槐二烯的產量［32］。

真核細胞的代謝被劃分在不同的亞細胞器中，不同細胞器合成的乙酰輔酶A不能透膜，乙酰輔酶A主要在線粒體中通過PDHC復合體產生，但目標代謝產物的生物合成通常在細胞溶膠中進行。因此將線粒體中的PDHC復合體重建至胞漿具有重要意義（圖1-B），可以在不積累副產物乙醇、不依賴ATP的情況下增加胞內乙酰輔酶A的供應［33］。然而，由于PDHC復合體亞單位活化輔因子硫辛酸的生物合成定位于線粒體，PDHC復合體在胞漿中的重建具有挑戰性［34］。

圖2 乙酰輔酶A的中央碳代謝優化策略

研究表明，天然乙酰輔酶A合成酶（ACS1、ACS2）對ATP的需求限制了MVA途徑下游產物的產量［33］。一項對途徑化學計量、自由能供應和氧化還原平衡的研究發現，當含有ATP依賴與ATP不依賴相關酶的乙酰輔酶A合成路線耦合時，法尼烯的理論產率最高［35］。然而，要實現乙酰輔酶A合成在這兩條途徑之間的精確分布，需要先進的合成生物學工具來平衡酶的相對表達水平和代謝通量。回顧近年的合成生物學進展，該設想已經實現。Meadows等［36］結合幾種策略來提高MVA途徑的能量效率并降低細胞需氧量，最終使釀酒酵母發酵產生了體積分數為15%的法尼烯。這些策略（圖1-C）包括異源表達5-磷酸木酮糖（X5P）特異性磷酸酮醇酶（xPK）和磷酸轉乙酰化酶（PTA），打通從X5P到乙酰輔酶A的通路，減少糖酵解帶來的碳損失；異源表達乙醛脫氫酶（ADA），降低ATP需求；通過敲除內源RHR2等基因，下調細胞原有PDH旁路流量。這種人工構建的非天然途徑將碳利用率（葡萄糖轉化為萜烯的比例）提高了20%，氧氣利用率提高至驚人的280%，使萜烯的工業生產成本大大降低，商業化規模生產變得可能。這也預示著中央碳代謝工程正處于一個高度活躍的領域，仍有許多針對于此的遺傳修飾可以嘗試，增加MVA途徑通量的潛力巨大。

3 平衡競爭途徑

3.1 在C15節點上控制MVA路徑競爭

酵母MVA途徑提供了幾種重要代謝物質，例如麥角固醇、泛醌、法尼醇、血紅素A、多氫酚等［37］。其中麥角固醇由鯊烯合酶（ERG9）將兩個C15法尼基焦磷酸（FPP）分子縮合得到。由于青蒿素和法尼烯等C15類異戊二烯產品也需要FPP作為前體，目標C15代謝產物合成與細胞自身生長所需代謝產物合成之間存在直接競爭關系［38］。通過更換啟動子（替換為MET3p或CRT3p啟動子）下調鯊烯合酶的表達，可以減少FPP向甾醇路徑的通量（圖3-A）［39］；通過將蛋白質降解標簽附著到角鯊烯合酶的C端，也可以成功地下調甾醇表達，該方法使奈洛哌啶醇的滴度提高86%，產量達100 mg/L［40］。通過dCas9靶向MVA途徑的啟動子來調控相關途徑酶的活化或抑制，實現轉錄水平的精細調節，從而控制通量流向，使得目標產物胡蘿卜素的產量得到提升［41］。其他基因表達的動態調控方法也已證明可用于控制酵母生長與生產之間的競爭，但尚未應用于類異戊二烯合成。例如，合成群體感應［42］、RNA干擾［43］、合成雜交啟動子［44］、合成應激反應啟動子［45］、合成mRNA莖環結構和核糖開關［46］，以上策略都具有MVA途徑中的通量重定向潛力。

3.2 C10和C20的異戊二烯磷酸代謝

C10單萜具有多種用途，可作為香料和高級生物燃料。由于MVA途徑中沒有專用的C10前體合酶，天然通量都被“聚集”到C15的生產中。天然酵母FPP合酶（ERG20）是一個雙功能酶，它催化C5異構體IPP和DMAPP縮合產生C10前體牻牛兒基焦磷酸（Geranyl diphosphate，GPP），同時GPP與IPP縮合生成C15前體FPP。ERG20的催化作用不會在GPP生成之后停止，導致GPP無法積累；同時FPP又是生物體內必不可少的前體物質，因此傳統的通量重定向技術（例如基因敲除）是不可行的。為克服該問題，Ignea等［47］使用各種蛋白質工程技術成功地將天然FPP合酶（Erg20p）轉化為GPP合酶（Erg20pF96W-N127W），使檜萜的產量增加了340倍（圖3-B）。重要的是，工程改造的FPP合酶保留了低水平的FPP合成能力，使其具備麥角甾醇合成能力以支持細胞生長。將蛋白質降解標簽K3K15與ERG20蛋白融合，同時結合甾醇應答啟動子進行動態反饋調節，可使芳樟醇的產量提高27倍（圖3-C）［48］。通過引入異源橙花基焦磷酸（Neryl diphosphate，NPP）合成酶，構建單萜化合物正交合成途徑，可以在不阻礙細胞生長的情況下高水平生產單萜（圖3-D）［34］。Cheng等［49］提出了工程化正交檸檬烯生物合成（OLB）途徑的策略，該策略組合NPP合成酶、以NPP為底物的檸檬烯合成酶，在酵母中實現了檸檬烯的高效合成。Ignea等［50］在釀酒酵母中引入西紅柿來源的橙花基二磷酸合酶（NPPS）合成NPP，替換原始前體GPP，構建酵母萜類化合物正交網絡，并通過鑒定決定單萜合酶中的異構底物選擇性的單一殘基F571，對5種不同的單萜合酶進行改造，以更高的速率與特異性接受替代底物NPP，實現了單萜化合物的高效合成。

C20二萜可形成結構復雜的分子，例如抗癌藥前體紫杉二烯［51］和香紫蘇醇等［52］。盡管酵母中有內源性香葉基焦磷酸（Geranylgeranyl diphosphate，GGPP）合酶（BTS1）生成C20前體，但它不能與ERG9和ERG20蛋白的催化作用進行有效競爭，這意味著GGPP庫的通量相對較小。Ignea等［52］通過氨基酸替換的方法對ERG20中同源區域的活性位點進行逆向進化，從而將FPP合酶（Erg20p）轉化為GGPP合酶（Erg20pF96C），實現了二萜化合物的工業化生產（圖3-E）。

圖3 競爭路徑平衡策略

4 細胞色素P450酶介導的萜類合成

類異戊二烯的合成生物學的另一個新興領域是通過細胞色素P450介導的氧化修飾反應生產復雜萜類化合物（例如抗瘧藥青蒿素、抗癌藥紫杉醇和抗癌/抗炎化合物丹參酮等）［53-54］。P450可催化多種氧化反應，包括向sp3雜化的碳原子引入氧原子、C=C雙鍵的環氧化、氮氧化、脫胺、脫鹵和脫烷基化。此外，P450還可以催化特殊的重排反應以及C-C鍵的斷裂等其他反應［55］。

與大腸桿菌相比，酵母作為萜類化合物的合成生物學“底盤細胞”，具有獨特的優勢，因為它兼顧了真核系統的功能性表達體系（可以表達復雜的真核蛋白，如細胞色素P450）和大規模微生物發酵的固有優勢。目前，釀酒酵母已經成功表達多種具有功能活性的植物來源的P450［56］。青蒿素在釀酒酵母中的半合成可以追溯到2006年［57］，首先通過導入黃花苜蓿中的紫穗槐二烯合酶（ADS）、紫穗槐二烯氧化酶（細胞色素P450酶，CYP71AV1）及其同源還原酶（CPR1）至釀酒酵母中，合成得到高達100 mg/mL青蒿酸［58］。然而。前體紫穗槐二烯在酵母中的表達量（150 mg/L）與大腸桿菌（25 g/L）相比很低［13］，紫穗槐二烯轉化為青蒿酸的能力也很差［53］。研究表明，高水平的青蒿酸生產與CYP71AV1及其同源還原酶的表達并非顯著相關，而是需要另外3種植物酶CYB5、ADH1和ALDH1的聯合表達來提高產率。此外，CYP71AV1：CPR1的表達比例也很關鍵，通過降低CPR1的表達，優化CYP71AV1：CPR1的表達比例，可實現青蒿酸的高水平生產（圖4-A），其在2 L發酵罐中產量高達25 g/L［12］。

實驗室規模的紫穗槐二烯和青蒿酸生物合成的工作在2008年完成［12，23］，而隨著青蒿酸轉化為青蒿素的化學工藝開發，青蒿素的商業化生產也于2013年實現［13，59］。合成生物學技術的發展使得研究者對P450酶的酶學信息的理解更加深入，打破了P450酶在微生物宿主中催化效率低、專一性差等困境，使得微生物高效合成復雜萜類化合物成為可能。此外，應用其他來源細胞色素P450合成高價值萜類化合物也是該領域研究的熱點。例如，在酵母中引入大戟和麻瘋樹來源基因ElC9OX1和JcC5OX2與ADH共表達，可促進千金二萜烷重要前體Jolkinol C的生物合成（圖4-C）［60］。通過進化樹分析，鑒定得到纈草中纈草酸合成所需P450酶VoCYP71DJ1，將其引入甲羥戊酸高表達的酵母菌株中，同時異源表達黃花蒿來源的脫氫酶AaADH1和AaALDH1，可成功合成倍半萜纈草酸（圖4-B）［61］。Grewal等［62］通過在酵母中異源表達P450酶CYP76AD1W13L、MjDOD、Mj-cDOPA5GT構建得到甜菜堿生物全合成通路，效價為17 mg/ L（顯色強度與10 g/L甜菜根提取物相對應），并可通過喂養不同的氨基酸使其呈現不同顏色。Sun等［63］通過計算機建模識別分析以及實驗改造來源于植物的P450單加氧酶CYP72A63中影響其化學和區域選擇性的關鍵殘基，從而改變其催化特性，實現了4種稀有甘草三萜化合物的特異性合成。Dai等［64］通過轉錄組分析以及酵母代謝工程平臺篩選得到了一種來源于植物山楂果實的P450氧化酶CYP716C49，通過實驗證明了酶具有廣泛的底物特異性，可用于五環三萜類化合物的C-2α位氧化。在迷迭香和一些鼠尾草物種的研究中，Bathe等［65］發現了兩組主要的細胞色素P450加氧酶，它們與松香烷二萜前體的氧化有關，其中CYP76AHs產生鐵銹醇和11-羥基鐵銹醇，而CYP76AKs在其C20位催化氧化；通過使用模塊化的Golden-Gate酵母表達組裝系統，系統地對這些酶進行了單獨或組合的催化測試，共檢測到其催化產生了14種松香烷二萜，其中8種是目前為止尚未報道的新化合物。

圖4 細胞色素P450酶介導的復雜萜類化合物的生物合成

5 展望

近年來，合成生物學的迅猛發展為微生物工廠生產高效、可持續的高價值萜類化合物開辟了新的機遇。合成生物學結合多個科學學科知識與工程學原理，將不同功能模塊引入適合大規模生產的微生物底盤細胞，擴展了原有生物系統生產高價值萜類化合物的可能性。應用合成生物學新工具與新方法，使得萜類化合物微生物合成的傳統策略重放異彩，創新成果也層出不窮：如異戊二烯前體途徑的優化不再每次只針對一種酶，而是通過合成生物學手段對其進行組合優化；細胞原有中央碳代謝的能量利用效率不高，則引入異源途徑進行精密耦合；酶的定向進化與修飾方法的成熟也顯著改善了目標萜類化合物合成酶催化效率不高、專一性低等問題，單萜二萜化合物的富集得以實現，復雜萜類化合物的異源細胞色素P450酶也得以高效表達。

盡管合成生物學還是一門年輕的學科，但隨著基因組裝、基因組編輯和數學建模技術的迅速發展，該領域正在迎來巨大的發展。這些進展加速了天然產物復雜的代謝途徑在底盤細胞中的裝配過程，也縮短了合成生物學研究的設計-建造-測試周期。同時，釀酒酵母作為常用的微生物工業生產菌株，在高價值萜類化合物的生物合成上顯現出了巨大的潛力。在可預見的將來，釀酒酵母作為底盤細胞在高價值萜類化合物的生物合成工業上仍將保持其最前沿的位置。