炎性標志物與缺血性卒中的研究進展

腦梗死是指各種原因導致的腦內血液供應障礙，引起腦組織缺血、缺氧性壞死。腦血流中斷5 min，神經細胞將出現不可逆損害。腦梗死病灶由缺血中心區和周圍的缺血半暗帶組成。缺血半暗帶恰好是局部缺血引起炎癥，造成腦損傷的關鍵部位。半暗帶雖然有損傷，但仍然有大量存活的神經元，及時給予正確的治療，可以逆轉腦組織損傷。因此探討缺血性腦卒中的炎性發生機制，合理利用炎性標志物，對腦卒中的診斷和預后評價尤為重要。阻斷炎性通路，減輕神經元損傷，將成為治療缺血性卒中的重要治療靶點之一。

1 腦梗死的炎性細胞反應

腦缺血觸發的炎性級聯反應是一個極為復雜的過程，涉及多種炎性細胞、炎性介質和多條炎性通路。腦缺血引起的急性炎性反應以腦組織內小膠質細胞和星形膠質細胞的激活以及外周血白細胞浸潤腦實質為特征。

1.1 白細胞 急性腦卒中后，中性粒細胞最先進入缺血腦組織，釋放一系列促炎介質，淋巴細胞次之(卒中后3～6 d)；外周血中的單核細胞迅速遷移至腦缺血損傷處，形成小膠質細胞或巨噬細胞，清除壞死組織。單核細胞和巨噬細胞同時表達抗炎和促炎介質，起雙重作用。單核細胞分為促炎型(Ly-6Chigh/CCR2+)和抗炎型(Ly-6Clow/CCR2-)。巨噬細胞分為MI炎癥型和M2抗炎型。低溫療法有利于M1型向M2型轉化[1]，發揮抗炎作用。不同類型的淋巴細胞對腦卒中的影響機制暫未明確。Wang等[2]發現，卒中病人T淋巴細胞和自然殺傷(NK)細胞水平明顯低于正常人，T淋巴細胞和B淋巴細胞含量與卒中嚴重程度呈負相關。Michael等[3]發現，B淋巴細胞對梗死面積無影響，而T淋巴細胞在卒中炎性反應中發揮著重要作用。CD4+、CD8+和γδT細胞通過釋放促炎細胞因子IFN-γ、IL-17等損傷梗死區腦組織。相反，調節T細胞(Treg細胞)通過釋放抗炎細胞因子IL-10、轉化生長因子-β(TGF-β)等保護腦組織[4]。抗CD28抗體(CD28SA)通過增加Treg細胞數量，減小梗死面積，改善功能缺損[5]。

1.2 小膠質細胞和星型膠質細胞 小膠質細胞為腦內固有免疫細胞，具有清除壞死組織的作用。在急性期，一方面小膠質細胞迅速活化釋放炎性介質，加快細胞損傷和死亡；另一方面，膠質原纖維酸性蛋白釋放增加，小膠質細胞會聚集在損傷區域，產生“無菌性免疫反應”。然而，Kanazawa等[6]用缺氧缺糖預處理小膠質細胞，28 d后，實驗組神經功能恢復明顯優于對照組，說明晚期小膠質細胞具有神經保護的作用。小膠質細胞的雙重作用可能與小膠質細胞的活化時間相關。有研究表明，小膠質細胞早期活化時有害而晚期活化能促進腦功能恢復[7]。星型膠質細胞在損傷前期會釋放一系列炎性介質、組織相容性復合物、共刺激分子，激活炎性反應；后期則表現為清除壞死組織與修復神經元。

2 炎性標志物及信號通路

2.1 炎性標志物

2.1.1 細胞因子

2.1.1.1 促炎細胞因子:(1)TNF-α：小膠質細胞中可見大量TNF-α表達，通常認為，TNF-α介導炎性損傷，阻斷TNF-α有利于減輕腦內炎性反應。但有研究發現，TNF-α除了有神經毒性，也可發揮神經保護作用。TNF-α的雙重作用與以下兩點相關。①與TNF-α的分布相關：分布于紋狀體的TNF-α將導致神經退行性變，而分布于海馬旁回多有神經保護作用[8]。②與TNF-α的結合受體相關：可溶性TNF-α與TNF受體1結合，介導神經損傷；膜結合型TNF-α與TNF受體2結合，介導神經保護[9]。低溫療法通過減少TNF-α、IL-1β等促炎因子表達，促進IL-10、TGF-β等抗炎因子表達，減輕炎性反應，改善腦功能[10]。

(2)IL-1：與包括卒中在內的人類多種疾病的發病機制密切相關，主要存在形式包括IL-1α、IL-1β。腦缺血數分鐘內IL-1α、IL-1β水平均會升高，IL-1β升高更明顯。實驗發現，與對照組相比，IL-1β敲除組小鼠梗死面積更小，證明IL-1β較IL-1α與缺血性卒中關系更加密切相關[11]。有趣的是，IL-1并沒有直接的細胞毒性，而是通過激活星型膠質細胞或內皮細胞，釋放炎性因子、血管黏附分子等間接途徑產生炎性損傷[8]。Pradillo等[12]在大腦中動脈缺血(MCAO)模型鼠中應用IL-1受體阻滯劑，MRI影像上可觀察到梗死面積減小50%。

(3)IL-6:卒中病人血清及腦脊液中均可表達IL-6，IL-6水平與卒中嚴重程度呈正相關。IL-6在缺血性卒中過程中發揮的作用尚有爭議。通常認為，IL-6是一種重要的促炎細胞因子，缺血后3 h開始表達，12 h達峰，24 h內IL-6水平持續增高。但也有實驗發現，IL-6敲除組小鼠梗死面積與野生鼠相比未見明顯差異[13]。甚至有研究發現，應用重組人IL-6可明顯減輕缺血損傷，證明IL-6可能發揮著抗炎作用[14]。此外，IL-6受體多態性盡管不增加缺血性卒中風險，但與預后不良密切相關。因此，IL-6或許可作為評價卒中預后的指標之一。

2.1.1.2 抗炎細胞因子:(1)IL-10: 除星形膠質細胞和小膠質細胞外，Treg細胞也可產生IL-10[4]，抑制炎性細胞因子受體的激活和表達，是阻斷IL-1和TNF-α的重要抗炎細胞因子[15]。臨床試驗發現，IL-10水平低的病人，卒中風險大大增高[16]。

(2)腫瘤壞死因子α誘導蛋白8樣蛋白2(TNF-α-inducible protein 8-like 2，TIPE2/TNFAIP8L2)：是近來新發現的抗炎蛋白，在小膠質細胞和巨噬細胞中都高表達。TIPE2通過負性調節T細胞受體和Toll樣受體維持免疫平衡。MACO模型鼠中，阻斷TIPE2，炎性細胞因子表達增加，梗死面積變大，神經功能缺損癥狀加重。未來，TIPE2有望成為新的抗炎治療靶點。

(3)類胰島素1號生長因子(insulin-like growth factor 1，IGF-1)：是一種在分子結構上與胰島素類似的多肽蛋白物質，具有降血糖、降血脂、舒張血管、促進細胞分化等多種作用。IGF-1不僅直接對受損神經元產生保護作用，還能抑制血腦屏障通透性，促進M2抗炎型小膠質細胞生長，抑制M1型的激活。臨床發現，升高IGF-1，有利于缺血性卒中病人神經功能的恢復[17]。

2.1.2 趨化因子:趨化因子是一類趨化炎性細胞遷移、介導炎性損傷的小分子多肽。根據靠近N端的前兩個半胱氨酸(C)之間是否插入其他氨基酸，趨化因子共分為C、CC、CXC和CX3C四個亞類。

單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)、基質細胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor,SDF-1)、不規則趨化因子(fractalkine，FKN)是研究最多的促炎趨化因子。正常腦組織幾乎不表達MCP-1。腦缺血時，MCP-1能特異性趨化單核細胞浸潤腦實質，促進黏附分子表達上調，造成缺血性腦損傷。實驗發現，MCP-1基因敲除組小鼠炎性因子表達較少，梗死體積減小，腦損傷減輕[18]。此外，MCP-1與其受體相互作用，能降低卒中后出血轉化幾率。Ruscher等[19]發現，阻斷SDF-1與其受體結合，能顯著減少白細胞浸潤及炎性因子釋放，血腦屏障破裂受限。同時SDF-1能促進骨髓干細胞向缺血腦組織遷移，改善局部腦血供[20]，從而減輕炎性反應，減小梗死面積。FKN是CX3C家族唯一成員，具有促進內皮細胞表達黏附分子，趨化炎性細胞與血管內皮黏附的作用。炎性狀態下，FKN能顯著抑制小膠質細胞釋放TNF-α、IL-6等，減少神經元死亡。

2.1.3 黏附分子:黏附分子通過促進白細胞向腦實質浸潤，參與炎性反應。免疫細胞和血管內皮之間的相互作用主要包括白細胞滾動、募集、跨內皮遷移3個步驟，通過3類黏附分子介導。(1)選擇素：P-選擇素、E-選擇素、L-選擇素；(2)免疫球蛋白超家族：細胞間黏附分子(intercellular adhesion molecules，ICAM)-1，ICAM-2、血管細胞黏附分子(vascular adhesion molecule-1，VCAM-1)、血小板內皮細胞黏附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1)、黏膜血管定居因子(mucosal vascular addressing cell adhesion molecule-1，MAdCAM-1)；(3)整合素：CD11a、CD11b。

2.1.3.1 免疫球蛋白超家族：目前研究最多的免疫球蛋白超家族成員是ICAM-1和VCAM-1。ICAM-1主要分布在內皮細胞、白細胞、上皮細胞表面，正常內皮中幾乎不表達。臨床發現，急性腦卒中病人血漿和腦脊液中ICAM-1和VCAM-1水平均升高，且與卒中嚴重程度相關[15]。用ICAM-1抗體阻斷ICAM-1，可減少白細胞向內皮細胞黏附，從而減輕腦損傷[21]。基于此，ICAM-1似乎是腦卒中新的治療靶點。然而在一項應用抗ICAM治療腦卒中的三期臨床實驗中發現，抗ICAM治療不僅不能改善卒中預后，反而加重，可能與實驗中ICAM抗體來源于鼠，并在體內通過補體激活途徑激活中性粒細胞有關。VCAM-1對腦卒中的影響尚有爭議。有研究發現，腦缺血后VCAM-1蛋白和mRNA水平均升高[22]。在缺血再灌注(tMACO)和永久阻塞(pMACO)2種模型中應用CD49d抗體，均能抑制白細胞浸潤，減小梗死體積[23]。

2.1.3.2 選擇素：白細胞從血管向組織遷移是炎癥發生的核心環節，而這一過程是由P、E、L 3種選擇素共同介導的。P選擇素和E選擇素主要參與白細胞滾動和募集。P選擇素過表達鼠梗死灶體積更大，阻斷P選擇素或E選擇素有利于減輕炎性損傷，促進神經功能恢復[15]。另有研究發現，腦缺血范圍不同，P選擇素的作用并不一致。局灶性腦缺血模型中，P選擇素基因敲除鼠神經功能缺損減輕。全腦缺血模型中，阻斷P選擇素盡管仍然能減少白細胞滾動，但生存率反而降低[24]。E選擇素能增加缺血性卒中的發病概率。L選擇素的作用尚未明確。盡管發現L選擇素可以介導白細胞募集，但在MCAO模型中使用L選擇素抗體，對腦卒中預后并無影響。

2.1.3.3 整合素：血液中的白細胞必須依賴整合素識別內皮細胞上的黏附分子，與之結合，才能穿越血管壁，浸潤腦組織，是缺血損傷發生的必要條件。Kawabori等[15]發現，阻斷CD11b/CD18，試驗組腦缺血灶內浸潤的中性粒細胞數量明顯下降，神經元損傷減輕，梗死面積下降。

2.1.4 基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)：MMPs是一種鋅依賴的水解蛋白酶，具有降解細胞外基質、促進炎性因子和中性粒細胞遷移的作用。在已報道的26種MMPs中，MMP-2和MMP-9與腦血管病密切相關。正常腦組織中，MMP-2和MMP-9呈無活性的低表達。缺血缺氧或炎性條件下，小膠質細胞、星型膠質細胞合成MMP-2和MMP-9增加。在炎癥的不同階段，MMP-9起雙向作用。早期，MMP-9降解細胞外基質，破壞血腦屏障，引起水腫、出血甚至神經元死亡；而在晚期，MMP-9通過與血管內皮生長因子(VEGF)等生長因子共同參與血管再生，減輕腦損傷。

2.1.5 活性氧族(ROS)：腦缺血后，腦血流量急劇下降，氧糖剝奪，線粒體被破壞，產生大量氧自由基，刺激ROS系統激活。卒中的研究重點主要是NADPH氧化酶(NOX)。研究證實，NOX1、NOX2、NOX4與缺血損傷密切相關。NOX2可能會促進斑塊破裂，同時激活炎癥凋亡反應，加重腦損傷。NOX4是氧化應激的主要來源，有學者認為，阻斷NOX4，能減輕甚至逆轉氧化反應，恢復神經功能，是抗氧化藥物治療卒中的思路來源之一[25]。

2.1.6 一氧化氮(nitric oxide，NO)：NO是一種相對穩定的氣體，能彌散到細胞和細胞膜內，發揮宿主防御、血管張力調節、免疫調節等作用。與卒中相關的一氧化氮合成酶(NOS)主要有內皮型NOS(eNOS)、神經元型NOS(nNOS)和誘導型NOS(iNOS)3種，其中iNOS與腦缺血關系最為密切，淋巴細胞、小膠質細胞等炎性細胞中均可見到iNOS。腦缺血后，iNOS活性增高，NO合成增加，NO與過氧化物反應生成過氧化氮，直接導致DNA損傷。

2.1.7 花生四烯酸代謝途徑：免疫細胞激活后，磷脂酶A2釋放，啟動花生四烯酸級聯反應。腦卒中后，腦血流中斷，鈣離子內流、聚集，細胞內高濃度鈣離子進一步活化磷脂酶A2，水解甘油磷脂，刺激花生四烯酸釋放。花生四烯酸代謝產物通過增強免疫反應導致缺血性腦損傷加重。與野生型小鼠相比，磷脂酶A2缺陷鼠腦梗死面積更小，腦水腫程度更輕，預后更佳[4]。

2.2 炎性信號通路

2.2.1 Toll樣受體(Toll like receptors,TLRs)：TLRs是存在人細胞表面的Toll跨膜蛋白，因與果蠅Toll分子高度同源而得名，其不僅在小膠質細胞、星型膠質細胞、血管內皮細胞、神經元中表達，在免疫細胞中也有廣泛表達。TLRs的胞外區富含亮氨酸重復序列，胞內區因與IL-1受體的胞內區同源，稱為TIR區的跨膜受體。TLRs的胞外區先識別相應受體然后通過胞內區的TIR結構域進行信號傳導。根據信號傳導方式不同，主要分為髓系分化因子88(myloid differentiation factor 88,MyD88)依賴型和非依賴型兩大類。除TLR3外，其余TLRs都是MyD88依賴型，通過調控NF-κB，進而啟動IL-6、IL-8、TNF-α等炎癥因子的表達。TLR3通過激活I型干擾素，啟動MyD88非依賴型途徑。而TLR4，既可以啟動MyD88依賴型模式，也可以啟動MyD88非依賴型模式。

缺血后壞死細胞產生熱休克蛋白、高遷移率族蛋白等內源性配體，激活TLRs特別是TLR2和TLR4，產生炎性介質，加上先天免疫反應，最終導致不可逆的腦損傷。臨床試驗發現，缺血性卒中病人外周血TLR2表達明顯升高[26]。腦缺血45 min后動脈注射TLR2抗體(clone T 2.5)，CD11b陽性細胞數量減少，神經細胞死亡率明顯下降[27]。然而，也有實驗發現，腦缺血再灌注損傷24 h后，TLR2基因敲除鼠腦梗死面積更大，證明敲除TLR2并不能抑制NF-κB的激活，相反抑制PI3K/Akt信號通路，加重炎性損傷。不同實驗中TLR2的雙重作用機制尚未明確，可能與實驗動物、造模類型、缺血再灌注時間、腦血流量等因素有關。相關分析提示TLR4與卒中嚴重程度密切相關。TLR4+單核細胞病人梗死體積明顯增加[28]。組織激肽釋放酶通過抑制TLR4/NF-κB，激活Nrf2信號通路，發揮抗炎、抗氧化應激的作用，保護腦組織。

2.2.2 絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases pathway, MAPKs)：MAPKs是細胞內重要的信號轉導系統，將細胞外的各種刺激，通過MAPKKK、MAPKK、MAPKs等細胞內信號分子，逐級傳遞至細胞核內，對缺血缺氧等病理刺激作出不同的反應，直接調節轉錄因子，控制細胞的增殖、分化。

與腦缺血密切相關的MAPK通路主要有4條：應激活化蛋白激酶(the stress-activated protein kinases/c-Jun N-terminal kinases，SAPK/JNK)，p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)，細胞外信號調節蛋白激酶5(extracellular signal-regulated kinase5，ERK5)，細胞外信號調節蛋白激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase1/2，ERK1/2)。缺血損傷后，這4條信號通路在神經元和星型膠質細胞中激活。但這些信號通路在腦缺血中所起的作用尚未完全明確。多項研究發現，JNK、p38的激活會導致神經細胞凋亡，ERK的激活有利于神經細胞缺血損傷恢復。

JNK信號通路可以促進IL-1、TNF-α等促炎細胞因子的產生。用銀杏內酯治療MCAO鼠，梗死灶體積、重量、神經功能缺損評分、腦水腫均顯著下降，TNF-α、IL-1β表達減少，且能下調半暗帶區域JNK1/2、p38 MAPK的表達，而對ERK1/2無影響[29]。p38 MAPK信號通路與JNK類似，通過激活小膠質細胞、星形膠質細胞產生促炎細胞因子。鼠MCAO模型中，膠質疤痕區可觀察到p38 MAPK活化，膠質纖維酸性蛋白表達增加。抑制p38 MAPK可以減輕星形膠質細胞遷移，但不影響其增殖。然而在p38 MAPK敲除的pMCAO模型中，鼠的梗死面積和運動功能未見明顯差異[30]。ERK5是最新發現的MAPK家族成員，其對卒中的影響機制并不明確。有研究發現，ERK5的激活有利于缺血保護[31]。針對JNK、p38 MAPK、ERK1/2信號通路的抑制劑將為缺血性卒中的治療提供新思路。

2.2.3 轉錄因子: NF-κB 廣泛存在于真核細胞內，對機體炎性反應和免疫調節有重要的調控作用。NF-κB主要由p50(NF-κB1)、p52(NF-κB2)、p65(RelA)、RelB、cRel構成。NF-κB的抑制物IκB與NF-κB二聚體形成復合物存在于胞漿中。細胞受到外界刺激后，IκB被磷酸化降解，從復合物上解離，NF-κB進入細胞核，誘導黏附分子、趨化因子、MMPs等多種促炎因子的轉錄。

缺血損傷后，神經元、星形膠質細胞、小膠質細胞中的NF-κB被激活，p65和p50表達增加，基因敲除p50后，梗死面積明顯減小。用p50的抑制劑(S-亞硝基谷胱甘肽)也可觀察到類似現象。

總之，腦缺血誘發炎性細胞、黏附分子、炎性介質、趨化因子等相互作用，形成所謂的炎性級聯反應。損傷血管內皮細胞、細胞外基質及血腦屏障，導致腦水腫、腦出血，最終造成腦組織壞死。多項研究均已證明抑制炎性反應有利于促進腦功能恢復，因此抑制超早期炎癥的不良反應，促進腦缺血后期腦組織恢復，將成為缺血性腦卒中治療新的思路。