核苷酸酶CD73在惡性腫瘤中作用和調控機制的研究進展

戚玉竹，劉 靜，張國君

(汕頭大學醫學院長江學者實驗室，廣東省乳腺癌診治研究重點實驗室，廣東 汕頭 515041)

研究表明，核苷酸酶CD73 在多種人類腫瘤中呈高表達狀態，與多種腫瘤的發生發展、轉移和不良預后密切相關[1]。但在不同腫瘤中，CD73 的作用方式和具體分子機制各有差異，因此，本文將圍繞CD73 在腫瘤生長、轉移過程中的作用及分子機制展開論述，旨在為惡性腫瘤患者的個體化治療提供新的潛在治療方案。

1 核苷酸酶CD73

人CD73是由NT5E基因(位于6q14-21)編碼的523個氨基酸組成的多功能跨膜糖蛋白，相對分子質量為70 000，其通過糖基磷脂酰肌醇(glycosyl phosphatidyl inositol，GPI)錨定在細胞膜上[2]。研究發現，CD73廣泛表達于人體多種組織細胞表面，包括淋巴細胞、內皮細胞和上皮細胞，控制多種生理作用，如上皮離子交換、液體轉運、血小板功能、組織乏氧以及血管滲漏等[3]。

CD73蛋白由3個結構域組成，N端結構域(27-317AA)包含2 個鋅離子結合位點和至少1 個位于311 位天冬氨酸的N-糖基化位點；C 端結構域(337-549AA)含有底物結合位點，并通過GPI 錨定器非共價結合到質膜上；N 端和C 端結構域通過一個短螺旋(318-336AA)連接，其可控制酶的運動。因此，CD73存在“開放”和“封閉”兩個構象，而催化反應需要CD73 從開放構象轉換為封閉構象，后者可暴露活性結合位點，允許底物結合[4]。

2 CD73在腫瘤發生發展中作用的分子機制

2.1 CD73水解酶功能在腫瘤發生發展中的作用

CD73 是核苷酸酶，可水解細胞外5′-單磷酸腺苷(adenosine monophosphate，AMP)，使其去磷酸化生成腺苷，并通過腺苷能信號通路起作用，而5′-AMP 的離解常數和抑制常數通常在低濃度范圍內(約50 μmol/L)[5]。在細胞中，CD39 和CD73 協同作用產生細胞外腺苷，即CD39 催化ATP 降解為AMP，CD73 進而水解AMP 為腺苷。前一過程可在膜結合再生酶的作用下逆轉，而CD73水解AMP生成腺苷是不可逆的過程。

除AMP 外，CD73 還可催化煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NADH)和煙酰胺單核苷酸，并降解為腺苷和煙酰胺核糖體，雖然該催化程度低于對AMP 的作用，但該發現提示了CD73 在NADH 代謝中的潛在新作用[6]。

CD73 的水解酶功能可影響腫瘤細胞的能量供給，對腫瘤發生發展的影響是多方面的。

2.1.1 促進細胞增殖Zhi 等[7]發現CD73 在乳腺癌組織中表達較高，且與惡性程度正相關。在乳腺癌細胞MDA-MB-231 中過 表 達 CD73 后 ，CD73 可 通 過 激 活 Akt/GSK-3β/β-catenin/cyclin D1信號通路促進乳腺癌細胞的增殖活性。反之，當利用干擾技術在MB-MDA-231細胞中敲減CD73的表達后，腫瘤細胞在異種移植瘤實驗中生長速度均明顯降低，且晚期凋亡細胞比例顯著增加。

此外，在乳腺癌細胞中過表達CD73，其酶活性可促使細胞進入S 期，G0/G1 期細胞比例減少，顯著增加細胞生存能力，促進細胞周期進展。相反，抑制CD73 促進細胞更多進入G0/G1 期，S 期細胞比例減少。使用CD73 抑制劑α，βmethylene ADP(APCP)也有相似的周期抑制作用[7]。

2.1.2 介導免疫逃逸免疫逃逸也是惡性腫瘤在體內迅速增殖的機制之一，為腫瘤的免疫治療提供了新的理論基礎。研究發現，CD73 可介導細胞毒性T 淋巴細胞逃避。低氧誘導因子(hypoxia inducible factor，HIF)依賴的轉錄機制可促進CD73+細胞在三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)的積聚；反之，抑制HIF 活性可阻斷化療誘導的CD73+細胞的富集，導致T細胞功能衰竭或死亡[8]。

此外，由于CD73 產生的游離腺苷可抑制細胞免疫反應，從而促進腫瘤細胞的免疫逃逸，提示CD73 可作為抑制性免疫檢查標記物[9]。

2.1.3 參與腫瘤血管生成 血管生成對惡性腫瘤的生長、轉移和預后有重要的影響，是重要的獨立預后標志。當腫瘤細胞中CD73 的活性受到抑制時，腫瘤異種移植物的血管生成減少，提示該酶參與了腫瘤血管生成。CD73+/+肺微血管內皮細胞(pulmonary microvascular endothelial cells，PMECs)較 CD73-/-的PMECs更容易形成毛細血管樣結構，且在腫瘤條件性培養基中培養時表現得更為明顯。同時，CD73 可降低內皮細胞對IV 型膠原的黏附，促進腫瘤細胞的遷移。此外，裸鼠實驗也證實，CD73+/+腫瘤大小和血管生成程度均高于CD73-/-小鼠，提示腺苷可以刺激血管生成[10]。

2.1.4 腫瘤組織屏障功能 許多研究表明，CD73 可參與腫瘤組織屏障功能的控制。白細胞，特別是多形核白細胞(中性粒細胞)在血管內皮細胞中的成功轉移是通過局部連接間隙的擴大和暫時的自變形來完成的[11]。研究發現，無論是使用APCP 還是抗CD73單克隆抗體1E9均可通過抑制CD73活性，進而抑制其酶解產生腺苷及細胞外核苷酸代謝通路，可抑制高達85%的內皮和上皮屏障的再密封功能。而中性粒細胞來源的AMP產生的腺苷通過激活腺苷A2B受體偶聯到細胞骨架的連接來增強屏障功能[12]。

2.1.5 產生耐藥性 Samanta 等[8]在研究中還發現，在TNBC 中化療藥物(卡鉑、阿霉素、吉西他濱或紫杉醇等)可通過調控HIF的活性，進而轉錄上調CD47、CD73 和PDL1 的表達，導致CD47+/CD73+/PDL1+乳腺癌細胞比例顯著升高，產生的腺苷使T細胞功能受損，抗腫瘤免疫功能下降。而Turcotte 等[13]。在FinHER 臨床試驗中證實HER2基因擴增的202例患者的基因表達譜，發現低CD73水平(中位數以下)的乳腺癌患者曲妥珠單抗治療明顯獲益，而CD73水平高(中位數以上)的乳腺癌患者無顯著獲益。在乳腺癌細胞H2N100皮下移植瘤小鼠模型中，CD73過表達可明顯抑制抗erbb2 mAb 的活性。由此證明CD73 與HER2/ErbB2抗體治療耐藥有關

CD73 可通過直接的、細胞自主的代謝改變，介導腫瘤對鉑類化療的敏感性。Peng 等[14]研究發現，CD73 可通過介導AKT/GSK-3β信號通路的活性促進腎癌細胞對舒馬替尼耐藥的發生。CD73在乳腺癌細胞BT-549和MDA-MB-231中表達相對較高，而沉默CD73 可逆轉其對順鉑的敏感性。臨床樣本的研究中也發現，CD73 在獲得鉑類抗性的細胞系中的表達高于敏感細胞系[15]。

2.2 CD73非水解酶功能在腫瘤發生發展中的作用

研究發現，CD73 除了其酶解AMP 參與腺苷通路發揮的作用外，還可作為調節細胞和細胞外基質成分相互作用的信號和黏附分子，調控腫瘤的侵襲和轉移能力，具有重要的非水解酶

Airas等[16]利用單克隆抗體4G4識別功能，證實淋巴細胞血管黏附蛋白2(lymphocyte-vascular adhesion protein 2，L-VAP-2)和CD73是相同的糖蛋白，因此CD73作為黏附分子調節淋巴細胞對內皮細胞的黏附作用。CD73 還可以下調血管內皮細胞黏附分子在血管內皮細胞的表達，調節血管的通透性[6]。在黑色素瘤中，CD73可與Concanavalin a 相互作用導致脂質筏與細胞骨架復合物的聯系增加。CD73 表達減少后，對Tenascin C層的黏附明顯減弱。提示CD73 除了酶解產生腺苷外，還可能在與細胞外基質成分的黏附和相互作用中發揮獨立作用[17]。

另有研究顯示，腫瘤細胞中CD73 和表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor，EGFR)表達呈正相關關系，CD73 可調節人乳腺癌細胞的EGFR 表達及其磷酸化，提示CD73可通過調控EGFR的表達來促進腫瘤細胞增殖[18]。

3 惡性腫瘤中CD73表達調控機制

CD73的表達受多種因素調控，與HIF、IFN-α等因子密切相關。雌激素受體(estrogen receptor，ER)、Wnt/β-catenin 和SMAD 信號通路以及microRNA 可以直接參與轉錄調控CD73 的表達，且CD73 的酶解產物腺苷可通過反饋調節影響其表達。此外，化學物質也可影響CD73的表達水平。

眾所周知，腫瘤組織內普遍缺氧，而缺氧條件可誘導腫瘤細胞內產生HIF 二聚體，后者可與CD73基因啟動子中乏氧反應元件(hypoxia-responsive elements，HRE)直接結合，從而促進CD73的轉錄[19]。

而干擾素IFN-α則可通過誘導其他調控介質間接促進CD73基因轉錄。在膀胱癌模型中，IFN-α膀胱灌注后，可促進內皮細胞產生CD73，且呈時間和劑量依賴性，在體內血管系統中CD73的上調顯著增加CD73介導的腺苷的產生，導致內皮細胞通透性降低，提示IFN-α是CD73 的體內調節因子，可通過CD73依賴性的腺苷產生，進而控制其誘導炎癥的程度[20]。

通過對體內信號通路的機制研究發現，在乳腺癌中發現ER 負調控CD73 的表達，ER 的缺失可顯著增強了CD73 的表達。雌二醇與ER 結合后，ER 入核與CD73基因啟動子Sp-1和Ap-2 結合位點，下調CD73基因的表達[21]。染色質免疫共沉淀檢測顯示轉錄因子SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD5 和SP1可與CD73啟動子結合，提示人類CD73的表達可能受到SMAD轉錄因子的調控[22]。

值 得 注 意 的 是 ， CD73 的 3′非 翻 譯 區 (3′-untranslated region，3′-UTR)包含1 774個核苷酸，超過了人類3′-UTR平均長度約3 倍[23]，因此，microRNA 對CD73 表達的轉錄后調控尤為重要，現已報道miR-30s、miR-187、miR-193b、miR-340及miR-422a等可直接靶向CD73 mRNA并抑制其表達[24-25]。

有趣的是，CD73 的產物腺苷可通過激活瘤細胞表面腺苷受體，增加細胞內cAMP水平，而cAMP與CD73基因啟動子中的cAMP應答元件(cAMP response element，CRE)直接結合，進而正反饋性上調CD73基因的轉錄[26]。此外，Yang等[27]通過高效液相色譜法測定，發現化學物質硫木林富馬酸氫(tiamulin，THF)通過降低CD73 的活性，而非CD73 的表達來抑制其作用，顯著抑制乳腺癌的生長和轉移。

4 以CD73為靶點的抗腫瘤治療潛能

Zhi 等[7]利用siRNA 干擾技術使CD73 功能缺失，發現細胞與基質的黏附能力、生長和侵襲能力顯著降低。目前研究提示單抗和化學藥物等靶向CD73 的多種應用在腫瘤干預中發揮重要作用。

免疫療法是一種新興的干預手段，通過直接刺激排斥類型的過程或阻斷抑制途徑，改變患者的免疫系統以對抗癌癥。在人類免疫系統中，CD73廣泛表達于T細胞和B細胞亞群、生發中心濾泡樹突狀細胞、胸腺髓質網狀成纖維細胞和上皮細胞。研究表明，抗CD73單克隆抗體導致CD73細胞表面聚集，繼而發生內化，從而抑制循環腫瘤細胞的外滲和定殖能力，進而抑制腫瘤轉移[28]。因此由核苷酸酶CD73產生的細胞外腺苷可作為一個新發現的干擾抗腫瘤免疫反應的“免疫檢查點”。Stagg等[29]在免疫健全的小鼠模型中，用抗CD73單抗成功阻斷了乳腺癌細胞CD73 的功能，顯著降低腫瘤生長速度和自發肺轉移的能力，但在免疫缺陷的小鼠模型中，單抗治療對腫瘤生長速度無影響，提示抗CD73 單抗的抗腫瘤作用需要機體適當的免疫力為基礎，而抗CD73的單克隆抗體還可以增強多克隆NK細胞對人卵巢癌細胞的溶解活性。

CD73 的抑制劑APCP 可選擇性抑制CD73 的生物活性，控制胞外腺苷的濃度以及調節其受體的活性，調節腺苷的生物信號轉導。Antonioli等[30]在小鼠黑色素瘤模型中，研究APCP聯合抗細胞毒性T 淋巴細胞相關抗原4(cytotoxic T lymphocyteassociated antigen 4，CTLA-4)的單克隆抗體的聯合作用，結果發現，APCP可增強抗CTLA-4單抗的活性，阻斷調節T細胞發揮功能中其關鍵作用的腺苷A2A受體，顯著抑制黑色素瘤的生長、增強抗腫瘤免疫反應，效果明顯優于兩者的單獨治療效果。另外，CD73 可促進體內有B16F10 黑色素瘤細胞的C57BL/6小鼠的新生血管形成，而抑制CD73可降低新生血管的數量并阻礙新生血管的成熟，從而減弱黑色素瘤的血管生成。

綜上所述，利用CD73 單克隆抗體、小干擾RNA 技術、CD73 抑制劑，均可顯著抑制腫瘤細胞生長和轉移，為抗腫瘤治療提供了新途徑。

5 展 望

研究表明，CD73 在惡性腫瘤發生發展過程有著重要作用，且CD73 的過表達與不同類型腫瘤患者的治療療效差和不良生存預后密切相關，提示CD73 有可能成為預測惡性腫瘤患者預后的生物標志物。通過單抗及化學方法抑制CD73 后，小鼠異體移植模型中腫瘤的生長及轉移得到抑制，抗CD73 治療與抗其他靶點單抗的聯合抗腫瘤效果更加明顯。目前，抗CD73 治療在小鼠模型的研究中并未出現嚴重的不良反應。由于CD73在生物體內的功能極其復雜，靶向CD73的新型治療模式必須對其可能會出現的不良反應進行嚴格論證才能應用于臨床。未來，更多的研究將致力于完整深入地闡述調控CD73 的酶活性及其參與的腺苷通路的理論，和進一步發掘CD73基因表達調控的機制。由此可以設計針對性的干預對策，從信號轉導通路和酶活性調節來抑制CD73 的功能，使之成為多種惡性腫瘤藥物治療的重要靶點。