植物抗白粉病MLO基因研究進展

田永賢， 陳 敏， 王其剛， 張 顥， 邱顯欽

(1.云南大學生命科學學院，云南昆明 650091； 2.云南省農業科學院花卉研究所/國家觀賞園藝工程技術研究中心，云南昆明 650205)

自然界中的植物與病原菌在長期的協同進化過程中形成了一種動態平衡關系，植物產生了一套保護自身的防御體系[1]。目前，國內外大量實驗室專注于研究植物的抗病機制，篩選出抗病的突變體植株，分離并克隆相關的抗性基因[2]，以培育生產所需的抗病植株。植物存在2類基本抗性基因，一類是抗病基因(resistace gene，簡稱R)，R基因是植物體中能特異性識別病原并能激發抗病反應的一類半顯性和顯性抗性基因，其特點是“基因對基因”式、專一和高效，因其種族特異性強，幾年內，病原菌便可克服R基因賦予植物的抵抗力而引起流行病大暴發[3-4]，原來的抗病品種因產生新的病原菌生理小種而喪失抗性。綜合評價其利用價值，用該基因培育抗病品種操作較容易且抗病性高，但其抗病性不能穩定和持久。另外一類是感病基因(susceptibility gene，簡稱S)，其為植物易感性所需，與植物的感病性有關，負調控植物的抗病過程。S基因功能的喪失會使植物獲得隱性遺傳的抗性，其等位基因正好彌補了R抗性上的缺點[4-5]，因此S基因的抗病模式是不同于R抗病植株的，而本文所分析的MLO家族基因就是S基因的一種。

1942年，Freisleben等使用X-rays(X射線)誘變了德國大麥(Hordeumvulgare)品種Haisa，獲得的突變體產生了對大麥白粉菌(Blumeriagraminisf.sp.hordei，簡稱Bgh)的廣譜抗性，mlo抗性從此為人們所了解[6]。1992年J?rgensen獲得了目前被普遍利用的mlo基因突變體中僅有的自發突變植株mlo-11[7]。隨后人們又從谷子(Setariaitalica)[8]、擬南芥(Arabidopsisthaliana)[3]、野薔薇(Rosamultiflora)[9]、豌豆(Pisumsativum)[10]和蘋果(Malusdomestica)[5]等植物中分離克隆了MLO同源基因，形成了MLO基因家族。目前僅發現其存在于植物和苔蘚類中，表明該家族基因是植物所特有的抗病基因[11-12]，MLO基因是一類單基因控制的隱性抗病基因，mlo突變體具有對白粉菌廣譜、高效且持久的抗性[7，11，13]。

傳統育種利用R基因來培育抗病品種，由于R基因高度的專化性，短短幾年，白粉菌便可克服這種抗性而產生新的生理小種，導致原來培育的品種失去對新小種的抗病能力，甚至可能引起新生理小種大暴發，極大影響作物的生產，因此R基因的利用不是一個長久之計。MLO基因是一種S感病基因，MLO基因對植物的抗病過程起負調控作用，野生型植株均能通過引起MLO基因功能喪失的突變獲得mlo基因抗性，由于mlo基因具有白粉菌持久而廣譜的抗性，因此這類基因在改善植物抗性方面具有廣泛的應用前景和開發潛力，MLO家族基因的研究對植物抗病育種具有十分重要的意義。

1 MLO基因的生物信息學研究

1.1 亞細胞定位

1999年Devoto等推測大麥MLO蛋白定位于細胞質膜上，現在已有大量研究進行了MLO蛋白的亞細胞定位，例如薔薇科(Rosaceae)植物的82個MLO蛋白中，大多數分布于質膜中，其次分布于內質網和液泡中，還有少量分布于細胞核、線粒體和高爾基體中[9]；激光共聚焦顯微鏡觀察發現，葡萄(Vitispseudoreticulata)的5個MLO蛋白均定位在細胞膜上，在細胞質內有少許的MLO蛋白[14]；谷子的12個MLO蛋白亞細胞定位分析表明，大部分MLO蛋白定位于細胞膜上，少數位于細胞核和細胞質中[8]；石甜甜等研究證明，糜子(PanicummiliaceumL.)MLO蛋白定位于細胞質膜上[15]。Bhat等發現無白粉菌感染的mlo突變體中大多數MLO蛋白聚集在表皮細胞周圍，在內膜及核膜上也檢測到了一些MLO蛋白，而在已接種白粉菌孢子的葉片上，真菌附著胞下呈現明顯的MLO蛋白聚集，這表明MLO蛋白在質膜中重新分布，且這種聚集受脂筏的驅動而不受肌動蛋白的影響[16]。李凡在無白粉菌感染的野生型和突變體的表皮細胞中均沒有發現MLO蛋白的特異性標記位點[17]，表明該蛋白在無白粉菌條件下的表達豐度較低，而在侵染后的表皮細胞內的吸器外基質中發現特異性的蛋白標記位點，說明MLO蛋白特異性地定位在吸器外基質中，侵染后的現象與Bhat等的研究結果[16]相同，即在病原菌侵染后，MLO蛋白會重新分布并且聚集在附著胞下方的基質中。另外在白粉病菌的吸器和菌絲等部位中均有膠體金的特異性標記位點，推測MLO蛋白可能是病原菌成功侵染所必需的1種寄主因子或者是病原菌發育的1種必要組分[17-18]。

Devoto等對MLO蛋白的亞細胞定位研究表明，MLO蛋白中心疏水區域具有7個跨膜結構域(seven-transmembrane domain，簡稱7TM)，其N端在細胞外，通常是與配體結合的結構域，C端在細胞內，存在與G蛋白結合的結構域[19]。MLO蛋白的拓撲結構、亞細胞定位及序列多樣性類似于動物和真菌7TM的G蛋白偶聯受體(G-protein coupied receptors，簡稱GPCRs)[20-21]。在動物中G蛋白偶聯受體GPCRs可以結合并激活異源三聚體G蛋白的活性，目前有研究從異源三聚體G蛋白是否參與MLO蛋白與白粉菌的互作過程來證明植物MLO蛋白是否具有G蛋白偶聯受體的功能，G蛋白由3個不同亞基(Gα、Gβ、Gγ)組成，調節植物許多基本過程，在植物中G蛋白復合物具有組成型活性，但其在該過程中的確切作用尚不清楚[22]。Kim等發現異源三聚體G蛋白不涉及MLO感病性或者突變型mlo介導的抗性活動，指出MLO蛋白似乎獨立于異源三聚體G蛋白起作用[23]；研究發現Gβ和Gγ亞基在擬南芥mlo-2突變體中參與調節抗真菌的防御反應，Gγ1亞基在該突變體中影響胼胝質的積累，但總體上與MLO蛋白作為典型GPCRs的作用不一致[22]。

1.2 跨膜結構域

過去一直認為MLO蛋白具有7個跨膜結構域[11，24-25]，如今研究發現MLO蛋白的跨膜結構域數量存在差異，例如，已公布薔薇科植物的81個MLO蛋白中，僅有1個MLO蛋白為4個跨膜結構域，其他的為5～8個跨膜結構域；閆沛喆等發現，蕓薹屬(Brassica)的123個MLO蛋白中有71個擁有超過7個跨膜結構域[26]；原子吸收光譜結果表明，糜子MLO蛋白沒有跨膜結構域[15]；陳玲等研究的85條MLO蛋白中，低等植物的跨膜結構域最多，為5個，高等植物有6～8個跨膜結構域[27]；Chen等研究認為，MLO蛋白數量在低等植物與高等植物間有所變化，不足5個跨膜結構域的MLO蛋白通常存在于低等植物中，跨膜結構域為4～8個的MLO蛋白通常存在于高等植物中[28-29]。陳玲等推測這種差異可能是由種間進化或不同物種自身特性促成的[27]，由此看出MLO蛋白跨膜結構域數量不是一定的，且僅部分MLO蛋白保持了該結構域數量上的保守性[29]。

1.3 鈣調素結合區

鈣調素(calmdouiln，簡稱CaM)是一類多功能的鈣受體蛋白，廣泛存在于真核細胞中，以受體的形式參與動植物細胞中多種酶和生理過程的調節。鈣調素特定結合區域(CaM binding domain，簡稱CaMBD)位于第7個跨膜結構域后10～15個氨基酸的位置[14，24，30]，該結構在已鑒定的MLO蛋白家族中非常保守[23，31]。向貴生等對HvMLO、TaMLO1、TaMLO2和TaMLO3的CaMBD結構域位置進行預測，結果與上述位置一致，但對薔薇科植物MLO蛋白該結構域進行預測時，發現CaMBD位于TM3與TM4之間，更接近TM4，與之前的結論是不相符的，由此推測CaMBD在物種的進化過程中可能出現了某些變化導致其位置發生了改變[9]。目前，大量研究支持MLO蛋白與鈣調素之間存在相互作用，并且MLO蛋白的活性受鈣調素調節，例如，Bhat等發現在入侵位點MLO蛋白與鈣調素的增加與病原菌成功入侵宿主細胞發生的時間一致，證明鈣調素參與了MLO與病原菌的互作[16]；王晏青通過酵母雙雜交方法驗證了VpMLO7蛋白與鈣調素互作[14]；有證據表明，鈣調素直接與受體結合，參與GPCRs介導的信號傳導過程，Kim等認為，MLO蛋白是一類新型鈣調素結合蛋白，調節植物的防御反應和細胞死亡，其活性受鈣調素的調節[23，32-33]。另外CaMBD結構域并不是存在于所有的MLO蛋白中，也不是具有抗病功能的MLO蛋白所特有的[34]。

1.4 信號肽的分析

信號肽是引導新合成的蛋白質向分泌通路轉移的短肽鏈，長度為5～30個氨基酸，位于分泌蛋白的N端，其可將進行翻譯的核糖體附著于粗面內質網上，并引導蛋白質輸送到細胞內不同膜結構的亞細胞內[35-36]。至今關于MLO蛋白中信號肽的研究相對較少，且只有少部分MLO蛋白具有信號肽，目前對信號肽的報道有：覃碧等對木薯(ManihotesculentaCrantz)MLO蛋白的研究發現，MeMLO8、MeMLO10和MeMLO18蛋白各有1個N端信號肽，擬南芥的3個蛋白AtMLO7、AtMLO8和AtMLO10也各有1個N端信號肽，這些信號肽均與第1次跨膜結構存在重疊區[34，37]，巴西橡膠樹HbMLO9含有1個N端信號肽[38]，感病小麥(TriticumaestivumL.)品種豫麥13和抗病品種紅蚰麥的MLO蛋白中均有1個信號肽[39]，小麥TaMLO8蛋白具有1個信號肽[40]，糜子PmMLO蛋白也具有信號肽[15]等。不是所有的MLO蛋白都含有信號肽，大部分MLO蛋白不具有信號肽，例如谷子的12個SiMLO蛋白[8]，巴西橡膠樹(Heveabrasiliensis)HbMLO7[41]、HbMLO1-1[42]、HbMLO8[43]、HbMLO12蛋白[44]，蓖麻(RiciunscommunisL.)15個RcMLO蛋白[37]，小扁豆(LensculinarisMedik.)13個LcMLO蛋白[45]，玉米(ZeamaysL.)ZmMLO蛋白[21]，木薯19個MeMLO蛋白，擬南芥12個AtMLO蛋白及小麥3個TaMLO蛋白[34]等均沒有N端信號肽結構。

1.5 C末端的保守結構域分析

雙子葉植物和單子葉植物的多重序列比對揭示出2個保守的肽結構域(Ⅰ和Ⅱ)，第1個位于鈣調素結合結構域下游15～20個殘基處，該保守結構域的特點是存在保守的絲氨酸和蘇氨酸殘基，第2區域位于C末端的遠端，是帶有共有序列D/E-F-S/T-F的肽結構域，值得注意的是，該模式在C-末端的一級氨基酸序列內的相對位置并未嚴格固定，該基序與上游(CaMBD和第一保守基序)和下游錨點(C-末端)的距離似乎是可變的[46]。目前，已從番茄(LycopersiconesculentumMill.)、擬南芥、大麥、水稻(Oryzasativa)、玉米、小麥、甘藍型油菜(BrassicanapusL.)、辣椒(CapsicumannuumL.)[28，46-48]及月季(RosachinensisJacq.)[49]等植物中克隆出MLO蛋白的2個保守基序。Feechan等提出MLO蛋白C端的這2個保守性結構域可能與植株對白粉病的敏感性相關[30，46]，并提出第Ⅳ和第Ⅴ分支中的MLO蛋白C末端均存在這2個保守結構域，其他分支也可能存在這2個結構域[46-47，49]，已公布的與白粉病互作的MLO基因均位于這2個分支中，但這2個分支上的MLO基因并不都是抗病基因[50]。向貴生等研究發現，這2個分支上的基因并不都具有這2個保守結構域，似乎這2個保守結構域只存在于這2個分支中具有抗病能力的基因中[9]。雖然大量研究發現，這2個保守結構域主要存在于有抗病能力的MLO基因中，但是這2個結構域并不是抗病基因所特有的，其他分支也存在這2個結構域，因此這2個結構域在MLO基因與病原菌互作中的作用需要進一步確定[47-48，51]。

1.6 MLO蛋白的保守性分析

Winterhagen等分析了17個葡萄和大麥MLO蛋白的氨基酸序列保守性，得出MLO蛋白中有30個保守的氨基酸殘基[52]。Elliott等分析了來自不同物種的38個MLO蛋白的氨基酸序列，指出MLO蛋白中同樣具有30個保守的氨基酸殘基[53]。劉寶玲等對谷子的12個MLO蛋白氨基酸保守位點預測發現，有1/2具有相同的30個氨基酸殘基，其余蛋白則突變或丟失了保守基序[8]。Zhou等對黃瓜14個MLO蛋白研究發現，只有6個保留了30個氨基酸，其他則為丟失和突變的氨基酸殘基[54]。Win等分析了南瓜的20個MLO蛋白，發現只有少部分保持了這30個氨基酸的完整性，其余都發生或多或少的氨基酸殘基的缺失或突變[55]。薔薇科的82條MLO蛋白中有15個保守基序，長度在15～50個氨基酸之間[9]；對黃瓜(CucumissativusL.)、甜瓜(CucumismeloL.)和西瓜(Citrulluslanatus)42個MLO蛋白的保守基序進行分析，結果發現42個MLO蛋白具有20個保守基序，長度在11～40個氨基酸之間[56]，這些保守基序可能與MLO蛋白的功能相關[57]。陳玲等在截選的MLO蛋白中發現，氨基酸變異位點占總氨基酸位點的84.14%，其中保守位點數僅占0.58%，體現出氨基酸序列具有較大的變異和較低的保守性[27]。變異區主要存在于N端、C端和胞外第1個環區域的序列[20，46]。

2 MLO基因功能分析

2.1 MLO家族基因的分類及其相關的功能

為了分析MLO蛋白成員間與其他物種MLO蛋白間的進化關系，常常構建系統進化樹，覃碧等構建了木薯和其他物種MLO蛋白間的系統進化樹，將MLO蛋白家族成員分為6類(Ⅰ～Ⅵ)，并推測感病MLO基因似乎僅限于第Ⅳ和第Ⅴ類[34]；李明想構建的系統進化樹將單子葉和雙子葉植物MLO蛋白分為6個亞家族，發現第Ⅳ和第Ⅴ亞家族的成員參與白粉菌的感病過程[5]；大多數研究把MLO基因分為7個亞家族，發現能與白粉菌互作的MLO基因可能只存在于第Ⅴ和第Ⅳ分支上[58-59]，且雙子葉植物中抗白粉病基因位于第Ⅴ分支，單子葉植物的該類基因都位于第Ⅳ分支上[55，60]。值得注意的是這2個分支上的基因并不都是與抗性相關的基因[50]。

研究發現，第Ⅲ分支上的MLO蛋白可能是被子植物受精過程中配子體功能的1個關鍵調節因子，可調控花粉管的發育，影響植物的育性[61-62]，Davis等認為，其他分支的MLO蛋白可能參與擬南芥的生殖生長[63]，EST(表達序列標簽)表達分析表明，MLO蛋白廣泛地參與到黃瓜、甜瓜和西瓜器官的營養生長和生殖生長中[56]。研究發現，HbMLO9和HbMLO1-1蛋白參與橡膠樹的激素信號傳導以及逆境響應過程[42，64]，蘋果MdMLO蛋白參與了機械損傷脅迫和外源水楊酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)及1-氨基環丙烷-1-羧酸(ACC)誘導脅迫過程[5]，水稻中4個和5個MLO蛋白分別與熱和冷脅迫的反應相關[65]，TaMLO8蛋白參與了條銹菌和白粉菌的抗病反應過程[40]，大麥MLO基因轉錄豐度隨著Bgh、稻瘟病菌、創傷、百草枯處理以及小麥白粉病產生的碳水化合物誘導物而增加。以上研究結果表明，MLO蛋白廣泛參與生物和非生物的脅迫反應[66]，MLO家族成員之間存在功能互作的現象，導致不同的MLO蛋白共同響應某種脅迫反應[5]。目前，許多研究表明，MLO基因的表達模式在不同的組織中存在著差異，在不同的組織中表達量不同，由這些差異推測MLO基因還存在其他的功能[13，64]。至今，已經發現了大量的MLO家族基因，但是對其功能的研究尚且不足，研究得最多的是MLO家族成員使植物易感染白粉病，第Ⅳ和第Ⅴ分支的成員類群主要功能與白粉菌的防御有關，但對其他分支的成員主要功能尚且分析不足。

2.2 與白粉病相關的MLO基因

王晏青研究發現，MLO基因在白粉菌誘導的早期表達量急劇上升，證明了MLO基因是在侵染的早期協助病原菌入侵寄主植株的[14]。野生型MLO基因能調控表皮細胞內乳突的形成，在表皮細胞壁真菌侵染位點抑制細胞壁過氧化氫暴發，并且抑制葉肉細胞次級氧化暴發和葉肉細胞死亡，利于病原菌的侵入，削弱了植物的防御能力，這類基因負調控植物防御能力以及細胞死亡[66-67]。MLO基因的缺失或移碼突變獲得等位基因mlo，導致MLO蛋白功能的喪失，解除了對白粉菌抗性和細胞死亡的負調控，因此植物產生了對白粉病的持久、高效和廣譜抗性。有研究證明，MLO基因并不是完全抑制抗性，Peterh?nsel等發現野生型MLO植物可以阻止30%左右的真菌孢子穿透宿主表皮細胞壁，并能觀察到mlo抗性產生的系列防御反應[68]；將額外的MLO基因導入野生型MLO細胞后敏感性的增加表明，內源純合野生型MLO基因抑制對白粉病的抗性反應是不完整的[23]；Piffanelli等認為，病原菌誘導MLO基因的組成型過表達與誘導之前的低表達相比可以解釋為野生型MLO對mlo抗性的不完全抑制[66]。

同一個基因也可具有多種功能，即基因功能具有多效性，例如抗病功能的基因可以同時響應傷處理[5]，在某些物種中，MLO基因的敲除會導致多種表型，例如，大麥葉片自發的細胞死亡形成的壞死斑點和大麥谷粒產量的降低[7，16，68]；擬南芥生長緩慢、早衰并且無感染的葉片出現自發的胼胝質沉積[3]；辣椒植株大小減少[48]。侵染白粉菌的轉基因pFGC1008-CmMLO甜瓜，具有白粉病抗性，同時植株出現卷須早，長勢較對照野生型植株弱，葉片大小、色澤沒有明顯區別[69]。但家養蘋果的MLO基因敲除并未觀察到這種或其他意外的多效表型[70]。小麥mlo突變體植株的高度、穗數及種子數較野生型沒有明顯的差異，也未出現較早葉片黃化的現象[71]。Ge等突變了埃塞俄比亞的1個大麥地方品種Eth295，發現其MLO突變不表現出自發壞死和光合組織丟失的多效性[72]。有研究者分析了影響這些多效表型形成的因素，Peterh?nsel等認為，自發的細胞死亡由MLO和ROR調控[68]，可能與突變體葉片的加速衰老有關[66]。Consonni等研究發現，胼胝質的自發沉積和衰老樣表型僅在Atmlo2pen2中被抑制，而不是在Atmlo2pen1或Atmlo2pen3中被抑制，這說明PEN2的突變補償了突變體中失去的表型[3]，而在大麥中mloror2突變體植株限制了這種多效性[68]。因此mlo突變體是否引起多效表型需要進一步的研究，如果能夠產生這種多效表型，那么之前研究發現的PEN2或ROR2是否影響這種多效表型以及是否其他因素影響這種多效表型都需要進一步的研究。

研究證明MLO基因存在功能冗余現象，導致突變的mlo基因對白粉病的抗性不同，因此在培育抗病品種時，當存在多個MLO基因拷貝同時調控白粉病時，植物要獲得高抗或者完全免疫白粉菌，需突變植株中起主要作用的MLO基因或者突變全部調控白粉病的MLO基因。Consonni等突變擬南芥的3個同源基因(AtMLO2、AtMLO6和AtMLO12)，通過形成單突變體、雙突變體和三突變體，證明了3個同源基因存在功能冗余，而AtMLO2在對白粉菌的防御過程中起主導作用[3，47]。Pessina等研究蘋果的MdMLO基因，敲除MdMLO19基因使白粉病嚴重程度降低75%，MdMLO11基因或MdMLO19基因與MdMLO11基因組合的敲除與單獨敲除MdMLO19基因相比不會導致任何減少或額外的易感性降低，證實了MdMLO19在植株中起主要的抗病作用[70]。Piffanelli等發現，大麥17個mlo的等位基因中，mlo-12和mlo-28基因僅有部分抗性，其余具有完全抗性[66]；Zheng等發現，同時沉默番茄SlMLO1及其同源物SlMLO5和S1MLO8賦予比與SlMLO1突變相關的更高水平的白粉病抗性，這證明與白粉菌互作的番茄MLO同源基因存在功能冗余[73]。這些研究結果均說明MLO基因存在功能冗余的現象。

3 MLO基因的抗病機制

3.1 表皮細胞中MLO基因的抗病調控

Blume等認為，細胞質中Ca2+的持續增加是激活細胞防御所必需的[74]。韓德俊等指出，表皮細胞外Ca2+的流入不僅是MLO基因表達所必需的，并且促進了胼胝合成酶(1，3-β-glucan synthase)活性提高從而有助于乳突的形成[33]。研究發現，表皮細胞中Ca2+的增加也能促成抗性的抑制，前期病原菌激發抗病反應，并引起Ca2+內流，但MLO的表達受到抑制；抗性抑制發生在后期MLO蛋白量的恢復時期，當胞質內的Ca2+迅速增加時，CaM的含量也顯著增加，而MLO蛋白的活性在CaM的調節下升高，抗性顯著被抑制，植物表現為感病性[23，75]。邵伯飛發現，鈣調素能夠使細胞維持一個低濃度的Ca2+水平，并且抗病或感病品種的表皮細胞是否成功被病原菌侵染依賴于胞質內的Ca2+是否保持較低的濃度。總的來說，Ca2+的增加既可引發抗性，同時也可以抑制抗性。在侵染后期，吸器外膜結構發生變化，鈣調素大量流入吸器外基質中[75]。野生型MLO植株接種白粉菌后，其表皮細胞的CaM蛋白主要積累于對著吸器部位的細胞壁內層，并認為CaM蛋白與代謝水平有關，因此推測這個部位的代謝更為活躍，可能有助于吸器的發育[18，76]。另外對MLO蛋白的亞細胞定位后發現，在病原菌的不同器官中以及吸器外基質中都有密集的特異性標記位點，推測MLO蛋白及其衍生物是病原菌成功入侵和發育所必需的植物因子和寄主因子[17-18]。基于這2種物質都主要定位于吸器外基質中，推測也可能在這個位置2種物質間互作調控了植株的抗病性。在表皮細胞中重要的一個防御方式是乳突反應(papilla response)，這是寄主抵抗白粉菌入侵時形成的一種典型的非專化型防御反應。乳突抗性體現為抗初侵染，而抗初浸染的關鍵在于高頻率快速產生乳突[77]。

3.1.1MLO基因調控乳突反應所需的滲透抗性通路MLO基因負調控植物的抗病反應，這種負調控與2個獨立滲透抗性通路相關，第1個通路由突觸融合蛋白PEN1/ROR2介導，該蛋白在調控囊泡運輸過程中發揮作用，并且MLO和ROR2蛋白之間存在直接的互作關系。糖基水解酶PEN2和ABC轉運體PEN3參與了第2個通路[78]。研究發現，大麥ROR(ROR1和ROR2)基因是mlo基因產生對白粉菌的完全抗性所必需的[79-80]，Collins等在擬南芥的突變體中分離出3個基因，分別是PEN1、PEN2和PEN3，這3種基因影響非宿主抗性，有趣的是，這3種基因也被發現是基于Atmlo2的白粉病抗性所必需的[80]。

第1個通路由突觸融合蛋白PEN1/ROR2介導，大麥ROR2和擬南芥PEN1互為直系同源基因，具有分泌的基礎功能和專門的防御相關功能，為乳突形成過程中的極化分泌事件所必需。PEN1/ROR2基因能夠編碼含有SNARE結構域的質膜駐留的突觸融合蛋白[78]。靶膜蛋白HvSNAP34(syntaxin-interacting N-ethylmaleimide sensitive factor adaptor protein receptor proteins)是SNAP-25(synaptosome-associated protein，molecular mass 25 ku)的一種同源物，是mlo基因完全抗性所必需的[80]，當其與突觸融合蛋白ROR2結合成二元SNARE(soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)復合物后，參與mlo抗性完全表達所需的生物囊泡運輸，因為SNARE蛋白具有介導胞外防御中的胞吐和/或囊泡融合事件，而MLO蛋白可調控細胞外周的SNARE蛋白介導的囊泡過程從而影響mlo抗性[16]。在mlo突變型的擬南芥中，生化研究表明PEN1在植物體內能與囊泡相關膜蛋白(VAMP)72亞家族成員相互作用，PEN1依賴性抵抗主要通過2個功能冗余VAMP721和VAMP722在體內起作用，遺傳分析表明，VAMP722優先與PEN1和SNAP33蛋白形成三元SNARE復合物，從而調控囊泡運輸[81]，依賴PEN1的抗病機制可能是限制入侵后病原菌的生長[3]。PEN1可直接調控mlo突變體的抗性，其突變直接抑制mlo的抗性[82]。

第2個通路由糖基水解酶PEN2和ABC轉運體PEN3所介導。mlo抗性依賴于PEN2和PEN3，據推測，PEN2(atypical myrosinase)和PEN3[ATP Binding Cassette(ABC) transporter]分別參與從硫代吲哚葡萄糖酸鹽衍生的有毒次生代謝物的合成和跨膜外流，以限制病原體的侵襲[83-84]，PEN2和PEN3不同于PEN1直接影響mlo基因的抗性發揮作用，而是這2個基因可能調控白粉菌進入宿主細胞的途徑間接調控mlo抗性[3]。PEN2和PEN3參與限制更廣泛的病原體的生長，包括適應性生物營養性白粉病、死體營養真菌和半營養卵菌[78]。

3.1.2 乳突的形成 Bushnell等認為，植物侵染白粉菌后的第一可見反應是宿主細胞質聚集在病原菌附著胞的下方，并把這種細胞質聚集形成的凝塊稱為細胞聚集體，該聚集體包括快速移動的細胞質、細胞器，具有與高代謝和合成活性區域相關的特征：豐富的線粒體、粗面內質網、高爾基體和多核糖體[85-86]。經生化分析和組織化學的研究表明，細胞聚集體內含有蛋白質、脂質和多酚類物質，木質素和纖維素表現為負染色，認為這2種物質不存在于該聚集體中[87]，Russo等證明有胼胝質的存在[88]。

大量研究表明，真菌釋放的化學誘導劑參與了細胞質聚集體的啟動[89-90]，而乳突的形成依賴細胞質聚集體的存在，在細胞聚集體形成不久便開始了乳突反應，并且主要產生在細胞質聚集的中心[86，91-92]。Zeyen等認為經過細胞質聚集體作用的乳突的沉積過程分為4個步驟[91]。在細胞聚集體中檢測到類似乳突成分的囊泡物質和水解酶類物質，在乳突及其周圍事物宿主細胞質的定位表明，乳突的形成是通過原生質體中分泌的囊泡內含物的積累，這部分內含物至少有一部分來自溶酶體系統[93]。在乳突的形成過程中，由于在細胞質聚集體中的與質膜結合的膜囊泡中發現具有類似的電子不透明性的無定形材料，甚至可以看到囊泡中存在胼胝質，在質膜附近經常觀察到與膜結合的囊泡，注意到囊泡膜-質膜連續性，能夠看到囊泡膜與質膜融合，推測這一過程使得囊泡釋放其內含物使這些物質嵌入乳突的表面，但隨著乳突的完全形成，細胞質聚集體就會分散，使乳突呈現一個完整的視圖[86，91]，乳突的形成有助于阻止白粉菌吸器的形成從而阻止病原菌的侵入，證明乳突的形成有抵抗白粉菌的作用[92]。

3.1.3 乳突的成分分析 植物的表皮細胞壁迅速加厚從而形成堅硬的乳突結構并產生抑菌成分，防止白粉菌的進入，抵制白粉菌的初侵染，乳突是在病原菌入侵位點的細胞壁和原生質膜間積累的半球狀體，并有物理和化學2種抗性，研究得最多的是物理抗性，即機械抵抗性和不通透性[16]。乳突特定的組成成分在不同植物中存在差異，通常發現一些類型的化合物，包括酚類、水解酶類、活性氧、細胞壁蛋白和細胞壁聚合物。在這些聚合物中，1，3-β-葡聚糖胼胝質是最豐富和普遍存在的組分之一，但胼胝質的作用仍不清楚[93-94]。Hückelhoven等認為，乳突滲透阻力與H2O2在這些沉積物中的高度局部積累有關[95]；Aist等認為，在mlo基因型的乳突中存在光吸收成分，其富含苯丙素和堿性染色成分，可能是mlo基因抗性機制的分子組分，但迄今為止還沒有發現和確定哪種物質是乳突抗性的決定因素[96]。直到最近，還沒有一種直接化學分析乳頭的方法可用，主要是因為它們非常小并且牢固地固定在植物細胞壁上[97]。

乳突在易感或抗白粉病的植物中都存在，只是在具有抗性的植物體中的乳突更大[70]。Kunoh等研究證明，乳突中存在Ca、P、K和Si等無機元素，并含有大量的低分子量元素，例如C、H、O和N等，這些無機元素是被選擇性地沉積到乳突中，而且隨宿主細胞的處理不同而變化。正常大小且幾乎不具有對白粉菌抗性的乳突中，其主要成分是Ca和K 2種元素，相反，過大且具有白粉病抗性的乳突中，主要含有Ca和P元素，證明磷酸鈣與白粉菌的抗性有關，因此高水平的Ca和P暗示磷酸鹽抑制水平的存在，可使得過大乳突具有抗性[97]。

3.2 葉肉細胞中MLO基因的抗病調控

葉綠體對植株抗病性的調控有著重要作用。葉綠體的存在能夠防止細胞衰老和為病原菌提供營養。超微結構研究結果表明，病原菌通過誘導植物感病品種葉肉細胞中新葉綠體的不斷產生來減緩葉肉細胞衰老，同時發現野生型MLO植株的葉肉細胞葉綠體中的2種光合作用標志酶的含量始終保持較高的水平，強的光合作用為病原菌的發育提供營養[18，98]。由此推測葉肉細胞可能是通過營養供給的方式調控表皮細胞的抗病性，葉肉細胞為表皮細胞提供了直接的養分來源，病原菌吸收葉肉細胞輸送到表皮細胞中的營養就可以完成其無性循環，植物從而表現為感病性，這種推測與Koga等的觀點相吻合，即在大、小麥中與葉肉細胞相接的短型細胞具有較強的感病性，而位于維管束上方，不與葉肉細胞相接的長型表皮細胞則具有較強的抗病性[99]。大麥mlo突變體植株，最先壞死的是葉肉細胞，添加外源單糖有助于延緩葉肉細胞的死亡，因此病原菌導致的mlo突變體植株葉肉細胞的死亡可能與其養分被病原菌大量吸收有關[17]。由此推測，因為野生型葉肉細胞中有持續的營養物質，促進病原菌發育的同時也維持了葉肉細胞的存活。趙淑芳等認為，葉綠體的死亡可能為鈣調素所調控[76]，由于MLO蛋白沒有定位于葉綠體中，說明MLO蛋白不直接作用于葉肉細胞，而是通過間接的方式來調控防御機制的[17]，關于MLO蛋白如何調控葉肉細胞代謝從而影響防御機制尚且沒有足夠的研究來證明。

大量研究發現，細胞的死亡與細胞內積累過量的H2O2有關[100-101]。Piffanelli等研究發現，mlo基因型葉肉細胞在H2O2激增后，葉肉細胞受到不可逆的損傷隨之發生細胞死亡，這2個反應均受MLO和ROR的控制，但沒有證明這2種反應是否有聯系，而野生型中MLO蛋白能夠抑制葉肉細胞的H2O2激增以及葉肉細胞的死亡[66]。Kumar等通過葉肉細胞H2O2大量存在與清除H2O2的對比試驗推測，葉肉細胞的死亡是由于病原菌產生的毒素致使細胞對氧化過程控制的喪失結果，不是細胞程序性死亡，認為H2O2的大量存在破壞了葉綠體從而引起葉斑病并導致壞死葉肉細胞的死亡，而MLO基因型植株能抑制H2O2的激增，也因此抑制了葉肉細胞的死亡[67]，閆亞杰等發現，活性氧積累得越多，細胞膜系統也損壞得更為嚴重[102]。

總的來說，葉肉細胞可能是通過營養供給的方式調控表皮細胞的抗病性，葉綠體能夠為白粉菌和葉肉細胞提供營養，從而維持白粉菌的發育和葉肉細胞的存活，MLO蛋白能夠抑制氧化暴發來抑制葉肉細胞的死亡，而氧化暴發又主要集中于葉綠體上[67]，那么MLO調控葉肉細胞的代謝和MLO調控氧化暴發是否存在關系？相關證據尚且不足，MLO蛋白是否還參與葉肉細胞中的其他反應也無從論證。Piffanelli等認為，自發的細胞死亡與突變體葉片的加速衰老有關，在衰老期間葉綠素含量下降[66]，可以猜想這種自發性葉肉細胞死亡是由葉肉細胞的營養轉移或葉綠素含量的下降從而導致葉肉細胞養分的丟失而造成的。

趙淑芳還提出了另一個類似于上述通過持續供給病原菌營養使得植物感病的發病機制，發現野生型MLO植株伴胞中較高的CaM含量有利于病原菌的發育，而伴胞有助于植物組織中有機營養的運輸，推測野生型MLO植株的有機物質可以迅速進行再分配，進而有利于吸器吸收營養而發育，從而抑制了植物的抗性[18]。但其并沒有表明鈣調素與伴胞中這種代謝的再分配之間的相關性。

4 MLO基因的應用和展望

白粉菌能夠寄生在大量單雙子葉植物中，危害植物的生長發育，傳統上人們主要通過噴灑農藥防治白粉病，或培育具有R基因的抗病品種，但是長期以來白粉菌能夠產生對農藥和R抗性的抵抗從而篩選出新的白粉菌生理小種，因此這2種抗病方式不適合應用于植物長期的抗病中。野生型MLO植物能夠促進白粉菌的入侵，但其突變體mlo植物具有對白粉菌持久而廣譜的抗性，利用MLO基因培育抗病品種具有重要的意義，大量研究表明，mlo基因具有多效性，因此在培育抗病品種的過程中，需注意克服MLO突變帶來的其他生理反應，培育高抗或完全抗性的品種還需注意MLO基因存在功能冗余的現象，以培養出所需的表型。目前國內外主要研究MLO基因及其所編碼蛋白的結構特征、功能和抗病機制，雖然發現MLO蛋白的抗病性與2個高度保守的結構域有關，但是還沒有發現或者確定MLO蛋白的抗病性為哪一區域所調控，不同分支的MLO基因存在不同的功能，至今第Ⅳ、Ⅴ分支上MLO基因研究得最多，其他分支的基因功能可做進一步的研究，完善MLO基因的功能研究。目前，人們的主要研究方向為表皮細胞和葉肉細胞里的抗病性機制、MLO基因調控這2個細胞的抗病反應，但是該基因如何調控這些抗病反應過程還未知，還有乳突起抗病作用的物質也有待確定，抗病機制的研究還不成熟。