細(xì)胞遷移顯微圖像自動檢測初探

齊丹丹 郭占欣

摘? 要：目的 針對細(xì)胞遷移的實驗結(jié)果處理需求，設(shè)計了一種操作簡單的細(xì)胞圖像自動檢測分析系統(tǒng)。方法 體外環(huán)境下設(shè)計細(xì)胞模型，使組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2在肺腺癌細(xì)胞A549中的表達(dá)呈現(xiàn)4種表達(dá)狀態(tài)，使用transwell小室實驗分別檢測細(xì)胞遷移能力相應(yīng)的變化，比較人工計數(shù)與自動檢測分析系統(tǒng)的結(jié)果。結(jié)果 EZH2表達(dá)下降會導(dǎo)致細(xì)胞遷移數(shù)目的減少，降低細(xì)胞遷移的能力。結(jié)論 對比分析傳統(tǒng)人工計數(shù)與自動檢測分析系統(tǒng)的結(jié)果，自動計數(shù)的方法有效可靠。

關(guān)鍵詞：細(xì)胞遷移;細(xì)胞圖像;自動計數(shù)

中圖分類號：TP391 文獻標(biāo)志碼：A? ? ? ?文章編號：2095-2945（2020）26-0072-02

Abstract： Objective： To design a simple automatic detection and analysis system for cell migration. Methods： The cell model was designed in vitro， and the expression of histone methyltransferase EZH2 in human lung adenocarcinoma cell line A549 showed four expression states. Transwell assay was used to detect the corresponding changes of cell migration ability， and the results of manual counting and automatic detection and analysis system were compared. Results： The decrease of EZH2 expression would decrease the number of cell migration and the ability of cell migration. Conclusion： The method of automatic counting is effective and reliable by comparing and analyzing the results of traditional manual counting and automatic detection and analysis system.

Keywords： cell migration; cell image; automatic counting

引言

細(xì)胞遷移是細(xì)胞的基本功能之一，是研究腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移常用的方法之一。細(xì)胞轉(zhuǎn)移會導(dǎo)致腫瘤疾病的惡化，增加腫瘤治療的難度，因此腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是臨床醫(yī)學(xué)中研究的熱點及難點[1，2]。在人體中有多個基因與腫瘤的發(fā)生轉(zhuǎn)移相關(guān)，其中1996年Hobert等人發(fā)現(xiàn)了EZH2基因，該基因可能參與了細(xì)胞遷移等一系列腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程[3]。其編碼形成的組蛋白-賴氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2在多種腫瘤細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)的狀態(tài)，表達(dá)狀態(tài)的高低與腫瘤細(xì)胞的惡性程度密切相關(guān)，即與細(xì)胞遷移等細(xì)胞功能密切相關(guān)。由此，EZH2可能成為腫瘤治療過程中的潛在作用靶點。

本文在體外環(huán)境下，利用Transwell小室實驗檢測不同EZH2表達(dá)量對于肺癌細(xì)胞A549遷移能力的影響。目前對于實驗結(jié)果的統(tǒng)計方法大都使用人工測量的方式，這種方式的結(jié)果具有較強的主觀因素，對于精密的實驗結(jié)果影響較大，并且實驗結(jié)果的處理會耗費大量時間和精力。現(xiàn)有的細(xì)胞圖像處理軟件需要實驗人員具備一定的圖像處理專業(yè)知識，增加實驗人員的負(fù)擔(dān)和實驗結(jié)果的不確定性。基于此，筆者開發(fā)了顯微細(xì)胞圖像一鍵操作模式下的自動量化分析系統(tǒng)，實現(xiàn)細(xì)胞自動計數(shù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

人肺腺癌細(xì)胞株A549（中科院上海細(xì)胞研究所細(xì)胞庫）;RPMI-1640培養(yǎng)基（規(guī)格：500ml，青霉素的含量為100U/ml，鏈霉素的含量為100ug/ml）購于天津鼎國生物公司;胎牛血清（FCS）購自Gibco公司;抗體包括ZH2單克隆抗體（兔源）、β-actin單克隆抗體（鼠源）、H3K27me3單克隆抗體（鼠源）、兔二抗的抗體以及鼠二抗的抗體;Transwell實驗中所用transwell小室，規(guī)格直徑為8μm，購自美國的Corning公司，染料為0.5%的結(jié)晶紫染料。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人肺腺癌細(xì)胞株A549是貼壁型細(xì)胞的一種，使用RPMI-1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清。在溫度為37℃和5%CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，兩到三天進行一次傳代。

1.2.2 細(xì)胞模型建立

使用EZH2的酶活性抑制劑GSK126刺激A549細(xì)胞，濃度分別為0μM、5μM、10μM、20μM。在24h后用Western Blot實驗驗證EZH2的表達(dá)效果（圖1）。

1.2.3 Transwell實驗

首先要將A549細(xì)胞進行饑餓培養(yǎng)，24h后進行鋪種。細(xì)胞消化收集后將其接種于24孔培養(yǎng)板transwell小室的上室中，接種密度為1×106個/ml，體積為200μl，transwell的下室加入600μl 的RPMI-1640完全培養(yǎng)基。上下室之間形成的培養(yǎng)基濃度差對細(xì)胞產(chǎn)生趨化作用，使具備遷移能力的A549細(xì)胞能夠透過小室上的濾膜貼在小室的下壁上生長。在上下室均加入等濃度的抑制劑GSK126進行藥物刺激48h后取出，加入結(jié)晶紫染色溶液染色后顯微鏡下成像計數(shù)。選取“上下左右中”5個視野點顯微鏡下采集圖像，統(tǒng)計5個區(qū)域中細(xì)胞數(shù)目的平均值，將其記錄為相應(yīng)抑制劑濃度下的細(xì)胞遷移數(shù)。本實驗重復(fù)3次，取其平均值作為實驗結(jié)果。

1.2.4 實驗結(jié)果統(tǒng)計

（1）人工統(tǒng)計：對5個視野點的顯微圖像進行人工計數(shù)，為了保證實驗結(jié)果的可靠性，計數(shù)過程中要對細(xì)胞圖像進行統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的計數(shù)，盡量避免人工計數(shù)的準(zhǔn)確性和主觀性。

（2）軟件測量：自主設(shè)計針對顯微圖像的自動檢測分析系統(tǒng)，細(xì)胞圖像輸入自動檢測系統(tǒng)后，無需實驗者進行圖像預(yù)處理，系統(tǒng)結(jié)合距離變化與分水嶺算法，自動完成細(xì)胞圖像的分割識別與計數(shù)，實現(xiàn)一鍵操作。

顯微圖像軟件測量的設(shè)計分為三個部分：第一，圖像預(yù)處理。采用高斯濾波以及形態(tài)學(xué)算法去除顯微圖像的噪聲干擾，增加圖像的對比辨識度。使目標(biāo)區(qū)域與背景區(qū)域差別增大，有利于目標(biāo)的識別計數(shù);第二，顯微圖像預(yù)分割。圖像的初步分割使用K聚類均值，有效的區(qū)分圖像的背景和目標(biāo)區(qū)域，而后應(yīng)用去除小區(qū)域步驟消除不是細(xì)胞的干擾目標(biāo);第三，顯微圖像精細(xì)分割。使用歐式距離的變換方式，對預(yù)分割的顯微圖像形成種子標(biāo)記圖，而后借助分水嶺算法的概念分割粘連細(xì)胞，準(zhǔn)確地計數(shù)顯微圖像的細(xì)胞總數(shù)。

1.2.5 實驗結(jié)果統(tǒng)計學(xué)分析

進行三次重復(fù)實驗，計算三次實驗的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，使用SPSS軟件的方差分析對實驗結(jié)果進行顯著性差異分析，將人工技術(shù)的結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)，分析自動測量軟件的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果

2.1 實驗結(jié)果一

使用自動測量軟件計數(shù)顯微圖像中的細(xì)胞數(shù)目，統(tǒng)計學(xué)運算得到實驗組和對照組之間的數(shù)據(jù)具有顯著性的數(shù)據(jù)差異（P<0.05），因此根據(jù)實驗結(jié)果可以得到EZH2表達(dá)下降會導(dǎo)致細(xì)胞遷移數(shù)目的減少，減弱細(xì)胞遷移的能力，對腫瘤惡化的抑制至關(guān)重要。

2.2 實驗結(jié)果二

以人工計數(shù)結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)，分析自動檢測軟件的準(zhǔn)確率，對比結(jié)果如表1所示。統(tǒng)計結(jié)果顯示自動計數(shù)的準(zhǔn)確率達(dá)到93%。相較而言，自動計數(shù)消除人工計數(shù)的人為主觀性，減少實驗結(jié)果處理的實踐，實驗結(jié)果較為準(zhǔn)確。

3 結(jié)束語

本文在建立細(xì)胞模型的基礎(chǔ)上，檢測了EZH2表達(dá)變化對細(xì)胞遷移的影響，對顯微圖像自動計數(shù)，極大程度上方便了實驗者的使用，避免實驗者耗費時間精力學(xué)習(xí)圖像處理專業(yè)知識，達(dá)到結(jié)果的自動定量分析。

參考文獻：

[1]李廣燦，葉召.全球常見惡性腫瘤的當(dāng)前流行趨勢[J].腫瘤防治研究，1999，26（4）：308-312.

[2]Chen YT， Zhu F， Lin WR， et al. The novel EZH2 inhibitor， GSK126， sup-presses cell migration and angiogenesis via down-regulating VEGF-A[J]. Cancer Chemotherapy & Pharmacology， 2016：1-9.

[3]Hobert O， Jallal B， Ullrich A. Interaction of Vav with ENX-1， a putative transcriptional regulator of homeobox gene expression[J]. Molecular & Cellular Biology， 1996，16（6）：3066-3073.