腫瘤缺氧微環境的研究進展△

馬苑，付秀華，王立紅#

1內蒙古醫科大學研究生學院，呼和浩特 010059

2內蒙古醫科大學附屬醫院呼吸內科，呼和浩特 010000

在惡性腫瘤的生長過程中，腫瘤細胞生長的速度超過其血管生長的速度，腫瘤細胞群周圍毛細血管的氧有效彌散范圍不能滿足腫瘤快速生長的需要，導致腫瘤組織內毛細血管的氧和營養供應不均，由此形成腫瘤缺氧微環境。隨著人類對腫瘤探索的逐漸深入，影像、病理、基因檢測、外科手術、化療、放療、免疫治療等診治手段的應用使抗腫瘤治療不斷取得新的進展，但是仍無法從根本上改善惡性腫瘤患者的總生存率，因此，亟待實施更加有效的腫瘤治療策略。近年來，以腫瘤的缺氧微環境作為腫瘤治療的新靶點，已取得初步成果。

1 缺氧微環境的發現

1955年，腫瘤缺氧現象首次被人類發現。缺氧微環境對人類腫瘤的遠處轉移的重要影響相繼被發現[1]。此后，人們從未間斷對缺氧微環境的研究，Le等[2]發現了肺癌組織中缺氧微環境的存在，這是人類最早發現的證明缺氧微環境在肺癌組織中存在的研究。后續研究發現，大部分腫瘤組織均存在缺氧微環境，實體瘤中常存在缺氧細胞[3]。

2 缺氧標志物

腫瘤細胞在缺氧狀態下可通過自身某些內源性基因表達的變化適應其賴以生長的微環境。目前，已知的調節因子包括缺氧誘導因子（hypoxiainducible factor，HIF）、碳酸酐酶 9（carbonic anhydrase 9，CA9）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、p53、促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）和血小板源性生長因子-β（platelet derived growth factor-β，PDGF-β）等，其中，HIF最受關注，其是一種轉錄因子，存在于人類所有細胞類型中，迄今已發現的HIF包括HIF-1、HIF-2、HIF-3，HIF在正常組織細胞對缺氧的急性反應中起重要作用，而在腫瘤細胞中，HIF誘導能量代謝的變化，并阻止缺氧誘導的細胞壞死。目前關于HIF-1的研究較多，其是細胞在缺氧應激時產生的轉錄激活因子，是一種由HIF-1α和HIF-1β兩個亞單位組成的異源二聚體，其表達與腫瘤的預后關系密切。CA9是一種生物酶，能可逆性地催化二氧化碳轉化為碳酸氫根離子和氫離子，通過其催化活性參與細胞內外pH的調節，而pH的改變是由缺氧誘導的細胞代謝產生過量的酸而引起的。CA9還能夠促進細胞的遷移和侵襲，在細胞黏附和擴散方面起一定作用。CA9賦予了腫瘤細胞在缺氧、酸中毒環境中生存的能力，并增強了其遷移、侵襲和轉移的能力，與多種腫瘤的發生、發展、治療效果和預后均有關。

3 缺氧與腫瘤血管生成

血管生成在腫瘤的發生、發展和轉移中起著重要作用，新生血管為腫瘤細胞供給營養和氧氣，是腫瘤生長和轉移的條件。關于腫瘤血管生成的機制已有大量研究，但仍未完全明確。研究證實，VEGF是最重要的血管生成因子，不僅可以特異性地促進內皮細胞生長，還可以增加新生血管的通透性。有研究發現，缺氧和HIF-1α、HIF-2α在腫瘤血管生成過程中發揮重要作用[4-6]。研究發現，HIF-1α參與非小細胞肺癌的血管生成，其中，HIF-1α和VEGF在肺癌組織中的表達水平明顯高于癌旁正常肺組織，且HIF-1α和VEGF的表達呈正相關[7]。

CC趨化因子配體28（C-C motif chemokine ligand 28，CCL28）是腫瘤缺氧誘導的趨化因子，在缺氧細胞培養模型中發現CCL28可促進肺腺癌血管的生成，且CCL28的分布與HIF-1α的分布一致，表達強度也與HIF-1α的表達強度相關；此外，肺腺癌患者血清中CCL28的濃度明顯高于健康供體，且與VEGFA的表達有關[8]。

研究顯示，腫瘤細胞分泌的外泌體在血管生成過程中具有調節作用，其能夠攜帶核酸、蛋白質等物質，主要包括具有調節基因表達功能的非編碼RNA。低氧環境中的腫瘤細胞集落分泌的外泌體過表達微小RNA（microRNA，miRNA）-23a，可在不同的血管生成模型中通過下調受體內皮細胞中SIRT1的表達誘導血管生成[9]。

Cbx4既是一種多梳蛋白，也是一種SUMO E3連接酶。有研究通過建立小鼠肝癌原位移植模型發現，在低氧條件下，Cbx4通過增加HIF-1的轉錄活性，促進缺氧誘導的VEGF在肝癌細胞中的產生和血管的生成，最終促進腫瘤的進展[10]。

4 缺氧與腫瘤侵襲、轉移

缺氧腫瘤細胞具有轉移的傾向，即腫瘤細胞在缺氧條件下會發生壞死的同時也會出現轉移[11]。腫瘤缺氧微環境與淋巴管生成密切相關，主要通過HIF-1α調控VEGF、轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、Prox-1 等信號級聯通路從而介導淋巴內皮細胞的增殖和遷移，這在腫瘤的侵襲和轉移中起著關鍵作用。腫瘤的侵襲與基質密切相關，大量促進腫瘤進展的基質細胞有助于缺氧區肺腺癌細胞侵襲行為的增強[12]。缺氧誘導膠原蛋白基因表達上調，其中，HIF-1和HIF-2可調節細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的降解，HIF激活轉錄程序導致基底膜降解，同時增加膠原纖維的合成[13]；HIF-1還可通過誘導成纖維細胞中P4HA1、P4HA2和PLOD2的表達，促進缺氧條件下ECM的重構，進而影響細胞的形態、黏附和定向遷移，由此形成腫瘤侵襲的物理途徑[14]。

一項對喉癌患者喉癌組織標本的研究結果顯示，缺氧不僅會促進喉癌細胞的侵襲和遷移，還可誘導GLUT-1、波形蛋白（Vimentin）、N-cad的表達，而這些蛋白陽性表達者的生存率明顯低于陰性表達者[15]。

缺氧微環境亦可誘發基因重組。一項對三陰性乳腺癌患者基因組的研究發現，早期缺氧可誘發基因組染色體不穩定性（chromosome instability，CIN）和腫瘤微環境（tumor microenvironment，TME）的重構，使腫瘤進一步發展[16]。此外，缺氧還可維持或增強正常干細胞和腫瘤細胞中的干細胞表型，促進腫瘤的惡性進展和耐藥性[17-18]。

近年來，抗血管生成藥物的應用使多種惡性腫瘤的患者獲益，研究表明，長期暴露于抗VEGF治療可能引起腫瘤的適應性逃避現象，從而誘導更具有侵略性的腫瘤表型[19]。

對非小細胞肺癌缺氧模型的研究揭示了巨噬細胞表型轉化促進腫瘤轉移的新概念，缺氧微環境通過白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）信號使M1型巨噬細胞向具有促進腫瘤發展作用的M2型巨噬細胞轉化，而高密度的M2型巨噬細胞與腫瘤轉移密切相關[20]。

5 缺氧與耐藥

缺氧微環境在腫瘤耐藥現象中的作用早已被提出，腫瘤細胞對治療誘導的細胞凋亡的抵抗性是抗腫瘤治療的障礙。多種腫瘤的復發和轉移是由微小殘留灶、腫瘤細胞的耐藥亞群導致的。缺氧通過誘導細胞周期靜止，抑制細胞的凋亡和衰老，控制自噬，影響p53和線粒體的活性，從而賦予腫瘤細胞治療耐藥性。腫瘤缺氧環境還通過表達藥物運載蛋白從而影響藥物的運輸和細胞對藥物的攝取，從而產生化療耐藥性。P-糖蛋白（P-glucose protein，P-gp）是一種位于細胞膜的外排型藥物轉運蛋白，與多藥耐藥基因1（multidrug resistance gene 1，MDR1）的表達有關，負責將各種結構的藥物排出腫瘤細胞，從而形成腫瘤多藥耐藥現象。研究發現，伴淋巴結轉移的浸潤性乳腺癌中HIF-1α、促紅細胞生成素的表達與P-gp的表達密切相關[21]。HIF-1α、TGF-β2 共同激活腫瘤耐藥基因GLI2的表達，導致腫瘤對化療藥物先天耐藥，而敲除HIF-1α/TGF-β2誘導的GLI2基因后，腫瘤對化療的耐藥性可發生逆轉，這更加證實了缺氧微環境可促進腫瘤的治療抵抗[22]。

放療通過產生活性氧不可逆轉地破壞腫瘤細胞的DNA，導致腫瘤細胞凋亡。消滅缺氧細胞所需的輻射劑量較消滅常氧細胞所需的輻射劑量高。由于正常組織對輻射的耐受性有限，一般不可增加放療的輻射劑量，因此，缺氧腫瘤細胞于放療后仍可能持續存在，形成更具侵襲性的腫瘤表型。此外，缺氧微環境可通過生成局部血管緊張素Ⅱ介導低氧腫瘤細胞的放療耐受性[23]。

繼放療、化療之后，抗血管生成藥物成為抗腫瘤治療的新策略，一些抗血管生成藥物已被美國食品藥品管理局（Food and Drug Admistraton，FDA）批準用于治療肺腺癌、結直腸癌、腎癌和中樞神經系統腫瘤。大多數抗血管生成藥物直接或間接地靶向抑制VEGF或其受體，然而，腫瘤缺氧條件下的抗血管生成治療可由于PIM激酶含量的增加而產生腫瘤耐藥性[24]。據報道，缺氧可使白血病、腎癌或胃癌對索拉非尼產生耐藥性，并可導致肝癌細胞獲得對多種抗腫瘤藥物（包括索拉非尼、5-氟尿嘧啶、吉西他濱、順鉑、多柔比星和6-硫鳥嘌呤）的耐藥性，其中，索拉非尼的治療效果受缺氧環境的影響較小，而5-氟尿嘧啶抑制腫瘤細胞增殖的作用會受到缺氧環境的嚴重影響；在經5-氟尿嘧啶處理的肝癌細胞中，缺氧不僅降低了胸腺嘧啶合成酶的水平，導致dTMP合成和DNA復制受阻，還影響了FdUTP的積累，導致DNA單鏈和雙鏈斷裂情況減少，抑制了DNA的修復，且進一步減弱了s期（DNA復制期）的阻滯，減輕了線粒體膜電位的損失，最終導致腫瘤細胞凋亡減少。因此，缺氧微環境可誘導廣泛且有差異的耐藥性的形成[25]。

6 缺氧靶向藥物

低氧活化前體藥物（hypoxia-activated prodrug，HAP）又稱生物還原烷化劑，是一種低活性的前體藥物，可在缺氧條件下被還原活化。目前正在進行臨床研究的HAP包括Evofosfamide（TH-302）、PR-104和Apaziquone（EO9）。TH-302是一種氮氧化合物，在小鼠模型中，應用TH-302聯合多柔比星或多西他賽治療后，慢性缺氧腫瘤細胞的增殖明顯受限[26]。VEGF抑制劑、放療聯合TH-302可完全阻斷腫瘤的生長，并且在停止治療后腫瘤靜止期持續超過3個月[27]。Peeters等[28]建立了動物模型，并在不同的氧合條件下進行放療和TH-302單獨及聯合治療，結果顯示，單獨治療后，腫瘤均出現了生長延遲，而二者聯合應用后，腫瘤的生長延遲進一步增加，TH-302可降低缺氧分數，其治療效果依賴于腫瘤氧合情況，增加腫瘤氧合可消除TH-302的作用，而增加缺氧分數可提高TH-302的治療效果。Kumar等[29]的研究也證實了抗血管生成藥物舒尼替尼聯合TH-302用于侵襲性神經母細胞瘤小鼠模型的療效，兩種藥物起到互相增強療效的作用。有研究發現，Evofosfamide應用于復發難治性骨髓瘤患者取得臨床療效[30]。

反式番紅花酸鈉（trans-crocetin，TSC）的滲透性強，能使氧氣快速地從紅細胞擴散至血管壁。作為多形性膠質母細胞瘤、胰腺癌和腦轉移瘤的放射增敏劑，在放化療聯合TSC治療的多形性膠質母細胞瘤患者中已完成了Ⅰb/Ⅱ期臨床試驗，證實其效果確切[31]。

CA9抑制劑與傳統藥物聯合應用于對放、化療不敏感的缺氧腫瘤細胞已初步取得成效。CA9抑制劑SLC-0111在臨床前體外實驗中取得良好的效果，增強了目前用于晚期黑色素瘤治療的達卡巴嗪和替莫唑胺的細胞毒性，增加了乳腺癌細胞對多柔比星的敏感性，還增強了5-氟尿嘧啶對結腸癌細胞的抑制作用[32]。

DHL是一種裝載血紅蛋白和抗腫瘤藥物多柔比星的脂質體，可增加缺氧環境中活性氧的產生，促進活性氧介導的多柔比星的細胞毒性，并提高腫瘤內藥物的積累，促進腫瘤細胞的內化，提高腫瘤區域的氧含量，最終增強化療對低氧腫瘤的療效，逆轉缺氧誘導的化療耐藥[33]。

Obatoclax是B細胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）家族蛋白的BH3仿生物，研究顯示，Obatoclax（OBX）聯合化療可抑制腫瘤細胞的生長、遷移和侵襲，同時增加缺氧腫瘤細胞對化療的敏感性[34]。

大腸桿菌生物工程的應用有望改變傳統放化療對正常細胞具有毒性作用的現狀。在乳腺癌動物模型中，通過大腸桿菌Nissle 1917（escherichia coli Nissle 1917，EcN）微細胞趨向腫瘤酸性微環境，向乳腺癌壞死和缺氧的區域運送化療藥物，最終達到腫瘤顯著緩解，且無嚴重不良反應，有效避免了全身使用化療藥物對正常組織細胞的毒性作用[35]。

氧化還原效應因子（APE1/Ref-1）是一種具有氧化還原信號活性的多功能蛋白，APE1/Ref-1信號通路通過HIF-1介導的轉錄過程促進CA9的表達，應用APE1/Ref-1抑制劑阻斷HIF信號通路，可有效殺滅腫瘤細胞。小分子APX3330是APE1/Ref-1的直接抑制劑，對APE1/Ref-1氧化還原信號具有高度選擇性。研究發現，在腫瘤細胞系中應用APX3330抑制APE1/Ref-1后，HIF-1信號和CA9 mRNA表達顯著下調，聯合使用APX3330和CA9抑制劑可增強對腫瘤細胞的殺傷作用[36]。

硼替佐米是一種蛋白酶體抑制劑，具有促進腫瘤細胞凋亡、抗血管生成和抗腫瘤細胞增殖的作用，同時具有抑制HIF-1α轉錄活性的能力，能通過阻斷低氧激活HIF-1的過程抑制腫瘤細胞對缺氧微環境的適應。美國FDA批準其用于治療多發性骨髓瘤和套細胞淋巴瘤，被廣泛應用于臨床實踐中。與其他抗腫瘤靶向藥物類似的是，由于蛋白酶體抑制劑具有非特異性，其對正常的組織細胞也有一定的破壞作用[37]。

7 小結與展望

腫瘤缺氧微環境是由于不可控的細胞增殖、代謝改變和腫瘤血管異常導致氧及營養物質運輸減少而形成的，其促進了腫瘤的進展、轉移以及耐藥性的形成，但其在腫瘤發生、發展過程中的確切作用機制仍有待探索。經過眾多研究者的共同努力，目前已有多種缺氧靶向藥物在臨床試驗中取得較好效果，且少數藥物已應用到臨床實踐中，這可能是一種有前景的治療思路，但仍然存在很多挑戰。例如，由于靶向缺氧微環境的藥物缺乏特異性，同時對腫瘤以外的缺氧組織細胞以及存在HIF的細胞會產生較多的不良反應，因此限制了某些治療方法的臨床應用。其次，與所有的抗腫瘤藥物類似，缺氧靶向藥物也不可避免地出現獲得性耐藥，從而使HIF及相關基因、轉錄因子重新激活。另外，腫瘤缺氧靶向治療的意義具有差異性，在不同患者、不同腫瘤類型中表現出不同的效果，期待更有效的腫瘤缺氧微環境靶向治療方法被發現。