基于Mekk2-/-小鼠研究貞術調脂膠囊調控β-catenin泛素化的成骨機制

孫平 李風英 楊國柱 韓曉蕊 陳鎮秋 何偉 洪郭駒,7* 郭姣

1.廣東藥科大學附屬第一醫院內分泌科，廣東 廣州 510080 2.青島市即墨區人民醫院內分泌科，山東 青島 266200 3.廣東藥科大學生命科學與生物制藥學院，廣東 廣州 510006 4.華南理工大學醫學院，廣東 廣州 510006 5.廣州中醫藥大學第一附屬醫院關節骨科，廣東 廣州 510405 6.廣州中醫藥大學嶺南醫學中心國家重點學科中醫骨傷科學實驗室，廣東 廣州 510405 7.加拿大阿爾伯塔大學醫學院骨外科部，加拿大 埃德蒙頓 T6G 2R3 8.廣東藥科大學，廣東 廣州 510006

糖皮質激素性骨質疏松(glucocorticoid-induced osteoporosis，GIOP)是由于長期使用糖皮質激素(glucocorticoid,GC)所導致的骨代謝紊亂，主要表現為血清游離脂肪酸含量增高、骨量減少、骨微結構破壞、骨脆性增加和易于骨折[1-2]。在10個國家進行的全球骨質疏松癥婦女縱向研究[3-4]中，有4.6%的絕經后骨質疏松癥患者正在服用GC。在GIOP的研究當中，GC介導β-catenin是調控骨代謝、促進骨形成的關鍵節點。而在近期的研究[5]中發現，除了經典的Wnt信號通路外，還存在促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶2(mitogen-activated protein kinase kinase kinase 2, MEKK2)的調控通路，有效地抑制β-catenin泛素化，維持β-catenin的穩定。

在前期研究中，筆者團隊發現以貞術調脂膠囊(FTZ)為代表的“補腎祛濕”法對治療GIOP有著優良的治療效果，對于抑制骨丟失、保存在體骨量有明顯的效果[6-8]。更重要的是，筆者團隊初步發現了FTZ對GIOP中的MEKK2-Wnt偶聯存在調控作用，從而拮抗GC副作用，改善骨微環境的骨脂代謝功能，促進成骨分化和抑制骨丟失[9]。鑒于此，本研究進一步通過CRISPR/Cas9技術建立Mekk2敲除C57BL/6 J小鼠，并提取小鼠原代成骨細胞，添加FTZ含藥血清進行干預，經與野生型小鼠成骨細胞比較，更深層次地挖掘FTZ拮抗GC抗GIOP的內在分子機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1Mekk2小鼠敲除方法與鑒定：采用CRISPR/Cas9技術,利用非同源重組修復引入突變的方式，造成Mekk2基因蛋白讀碼框移碼，功能缺失，敲除設計策略見圖1。具體操作如下：通過體外轉錄的方式，獲得Cas9 mRNA和gRNA。將Cas9 mRNA和gRNA(Cas9和gRNA體外轉錄信息見表1)顯微注射到C57BL/6 J小鼠的受精卵中，獲得F0代小鼠。在獲得F0代小鼠后，經PCR產物測序確認，共獲得8只目的基因蛋白讀碼框移碼的F0代小鼠；選取陽性的F0代小鼠分別與野生型C57BL/6 J小鼠交配，獲得的F1代小鼠。鑒定方法同F0代小鼠鑒定。選取F1代剛出生乳鼠用于原代成骨細胞提取，選取F1代的6-8周敲除小鼠用于MicroCT檢測。

圖1 Mekk2敲除策略示意圖Fig.1 Schematic diagram of Mekk2 knockout strategy

表1 在Mekk敲除中的Cas9和gRNA體外轉錄信息Table 1 The transcription information of Cas9 and gRNA in Mekk2 knockout

1.1.2野生型乳鼠來源及培育條件：用于受精培育、MicroCT及含藥血清制備的小鼠為C57BL/6，雌雄均有，SPF級，6～8周齡，小鼠體重18～20 g；用于原代成骨細胞提取的乳鼠為C57BL/6品系的5 d大乳鼠。由廣州中醫藥大學動物實驗中心[SCXK(粵)2013-0001]標準飼養，實驗過程中對動物的處置符合中國科技部頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》。培育條件室溫控制在23 ℃～25 ℃, 相對濕度50%～60%, 光照時間07:00～19:00, 自由飲水及進食。

1.2 方法

1.2.1MicroCT檢測小鼠骨組織表型：將6～8周野生型小鼠和Mekk-/-小鼠處死后取右側脛骨，置于Micro-CT平臺上，從脛骨近端掃描至遠端，得出整個脛骨的3D重建層面圖片。通過Micro-CT自帶計算機分析系統根據所創建圖片的有效信息，依次計算骨表面積與骨骼體積比(BS/BV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁數目(Tb.N)、骨小梁間隙(Tb.Sp)。

1.2.2FTZ含藥血清制備：小鼠(共10只)先適應性飼養7 d，給藥前將小鼠禁食6 h。將復方貞術調脂膠囊(購自廣東藥科大學附屬第一醫院)剖開，參照人用藥量及所規定的人與鼠體表面積關系得出小鼠所需的等效劑量，以5倍等效劑量對小鼠進行藥物灌胃，2次/d，連續7 d。末次灌胃1 h后，行淺麻醉，心臟取血1～2 mL。室溫靜置30 min后取上清液，3 000 r/min離心15 min，分離血清，取上清液,冰凍保存備用。每次使用10 %含藥血清(1 mL培養液中添加0.1 mL含藥血清)作為添加量。

1.2.3成骨細胞培養和分化測定：通過膠原酶II消化從5 d的新生乳鼠頭蓋骨中分離出細胞。將細胞在含有抗壞血酸和β-甘油磷酸的培養基中培養，以分化成原代成骨細胞。將原代成骨細胞培養于含有10 %FBS、2 mmol/L 1-谷氨酰胺、1%青霉素/鏈霉素的α-MEM培養基中。

1.2.4免疫沉淀(PI)實驗：用裂解液裂解成骨細胞，測定蛋白濃度，向蛋白上清液中加入1.0 μg IgG和80 μL protein A/G珠子孵育，離心后取上清，加入10 μL抗體沉淀p-MEKK2/3和MEKK2并孵育過夜，再加入80 μL A/G-珠子孵育，收集免疫沉淀物，加入緩沖液，剩余步驟同1.2.5。

1.2.5Western blot實驗：將細胞裂解液與緩沖液混勻形成樣品，吸取樣品與預染蛋白marker注入電泳，350 mA轉膜3 h。隨后5%脫脂奶粉封閉1 h。加入一抗(β-catenin及p-β-catenin，均按照廠家說明稀釋，Sigma公司，美國)。經孵育過夜后，TBST洗滌并加入相應二抗。最后在凝膠成像系統中進行曝光和成像分析。

1.2.6Luciferase報告實驗：將0.5 μg的TOPflash質粒和50 ng海腎熒光素酶質粒瞬時轉染在12孔板上生長的C3H10T1/2細胞(Thermo Fisher Scientific公司，美國)。轉染24 h后按空白對照組、FTZ含藥血清、Wnt3蛋白(Sigma公司，美國)以及FTZ含藥血清和Wnt3共同干預，繼續培養48 h，隨后裂解細胞，并使用雙重熒光素酶報告基因測定系統獲得標準化的熒光素酶活性。

1.3 統計學處理

計量資料以均數±標準差(mean ±SD)表示, 所有統計分析均使用SPSS 22.0統計軟件處理。組間均數比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Mekk2+/-小鼠構建與鑒定

經受精卵顯微注射，本研究共獲得38只F0代小鼠。通過PCR的方式，對F0代小鼠的基因型進行鑒定，共獲得8只目的基因蛋白讀碼框移碼的陽性F0代小鼠；F0代小鼠PCR產物,經測序，陽性F0代陽性小鼠(1號和16號)分別與野生型C57BL/6 J小鼠交配，最終獲得6只F1代雜合子小鼠(Mekk2+/-)。

2.2 Mekk2-/-小鼠培育

將獲得的Mekk2+/-小鼠(Mekk2+/-)分成兩部分：一部分雜合子小鼠與野生型小鼠交配，擴群繁育較多的Mekk2+/-小鼠；一部分雜合子小鼠自交，獲得基因敲除純合子小鼠(Mekk2-/-)，本實驗最后共獲得Mekk2-/-乳鼠20只用于原代細胞提取。

2.3 Mekk2-/-小鼠與野生型小鼠表型差異

采用MicroCT對Mekk2-/-小鼠與野生型小鼠進行骨組織的表型檢測。結果提示，Mekk2-/-小鼠與野生型小鼠相比，前者BV/TV、Tb.N、Tb.Th值降低(P=0.014，P=0.035，P=0.028)，Tb.sp無差異變化(P=0.084)。見表2。

表2 MicroCT檢測Mekk2-/-小鼠與野生型 小鼠骨組織Table 2 MicroCT detects the bone tissue of Mekk2-/- mice and wild type mice

2.3 FTZ含藥血清激活MEKK2以穩定成骨細胞中的β-catenin

分別加入FTZ含藥血清以刺激野生型小鼠成骨細胞和Mekk2-/-成骨細胞，干預時間為10、20、40 min，并通過Western blot分析β-catenin(S675)的磷酸化水平。結果提示，FTZ含藥血清在40 min時可增強野生型小鼠細胞β-catenin(S675)的磷酸化水平(P=0.026)，但是在Mekk2-/-小鼠細胞中則明顯降低，特別是在40 min時(P=0.032)。見圖2。

圖2 FTZ含藥血清促進β-catenin磷酸化水平 A：FTZ含藥血清添加到野生型(WT)小鼠和Mekk-/-小鼠的成骨細胞，干預時間在0、10、20、40 min不等，Western blot檢測p-β-catenin表達水平；B：p-β-catenin與β-catenin表達水平比率。Fig.2 FTZ containing serum promotes phosphorylation of β-catenin A：FTZ containing serum is added into the primary osteoblast of wild type mice and Mekk2-/- mice at 0, 10, 20, 40 mins. Western blot is used to detect the expression of p-β-catenin；B：the ratio of p-β-catenin and β-catenin.

2.4 FTZ含藥血清誘導MEKK2磷酸化

在野生型小鼠原代細胞中，采用FTZ含藥血清和FGF2(誘導MEKK2的激活因子)對細胞進行干預。結果發現，FTZ含藥血清和FGF2干預后的原代細胞中，p-MEKK2/3表達水平均比不干預時細胞增強(P=0.003，P=0.008)，且二者提高水平不存在明顯差異(P=0.062，P=0.071)。見圖3。

2.5 FTZ含藥血清促進β-catenin活化

將TOPflash質粒和海腎熒光素酶質粒瞬時轉染入C3H10T1/2細胞中。用FTZ含藥血清或Wnt3a以及二者共同干預細胞。結果提示，FTZ含藥血清和Wnt3a均促進β-catenin活化，而FTZ含藥血清和Wnt3a共同干預細胞后，可見β-catenin活化程度更高，效果呈累加效應(P<0.05)。見圖4。

圖3 FTZ含藥血清誘導MEKK2磷酸化 A：FGF2(25 ng/mL)與FTZ含藥血清共同干預野生型小鼠原代成骨細胞，并用免疫沉淀技術檢測p-MEKK2/3和MEKK2表達；B：p-MEKK2/3和MEKK2表達水平比率。Fig.3 FTZ containing serum induces phosphorylation of MEKK2 A:FGF2 (25 ng/mL) and FTZ containing serum are added into the primary osteoblast of wild type mice. Immunoprecipitation is used to detect the expression of p-MEKK2/3；B: the ratio of p-MEKK2/3 and MEKK2.

圖4 FTZ含藥血清和Wnt3a促進β-catenin活化Fig.4 FTZ containing serum and Wnt3a promoteβ-catenin activation

3 結論

GIOP的發生和發展密切關系著骨吸收破壞的平衡穩定或者失衡，通過藥物尋求再平衡至關重要[10]。從細胞層面上看，GC抑制Wnt/β-catenin經典通路，加速β-catenin磷酸化降解，從而激活泛素系統，是造成GIOP的重要環節和基礎分子機制。當GC超量時，抑制β-catenin泛素系統的上游機制被阻斷，可抑制Wnt下游因子[11-12]，激活Wnt抑制因子[12-17]，更可以抑制Wnt自身表達[18]。而最新的研究發現，MEKK/SET11亞家族成員MEKK2可有效地抑制β-catenin的泛素化。研究[5]指出，由FGF2所激活MEKK2可以通過USP15的募集，從有別于Wnt經典通路之外，實現抑制β-catenin泛素化的效果，從而阻止其組成蛋白酶產生周轉。這一種創新性發現，提出了MEKK2的正向調控對實現細胞內β-catenin的穩定性具有開拓性意義。基于此，筆者團隊認為，如果能尋找到正向介入MEKK2通路的效用藥物，即可以發揮與Wnt經典通路同樣的預期效果。

在既往的研究當中發現，FTZ中藥方劑的效用機制契合GIOP骨脂代謝分子機制，在生物表型上能夠系統解決骨組織內脂肪沉積，成骨活性減弱，骨代謝紊亂等[6-8]。這也是FTZ作為降脂類中成藥在骨科領域的發展。筆者團隊經研究進而發現，在GIOP模型當中，FTZ不僅提高了骨量，抑制了骨質疏松的進展，同時還調控骨組織內Wnt3a、MEKK2、β-catenin蛋白表達，這提示FTZ通過MEKK2-Wnt偶聯信號通路從而促進GIOP成骨功能。在細胞層面也證實了這一點，FTZ同時促進了β-catenin和MEKK2的蛋白表達。另外，研究[9]還發現，FTZ可增強β-catenin/TCF/LEF轉錄活性，從而激活Wnt/β-catenin信號通路下游靶基因的表達。

基于上述研究基礎，筆者團隊更深入地通過建立Mekk2-/-小鼠，經與野生型小鼠比較，觀察成年小鼠的表型改變。結果顯示，Mekk2-/-小鼠的成骨量比野生型小鼠減少，盡管在重建當中未見骨小梁的結構紊亂，但是Mekk2-/-小鼠因缺少Mekk基因而導致骨發育的遲緩與不足是明顯的，這與文獻當中的結論是一致的。本研究又通過提取Mekk2-/-小鼠和野生型小鼠的原代成骨細胞，研究FTZ對于β-catenin磷酸化的作用。結果表明，FTZ在Mekk2-/-小鼠的成骨細胞中，β-catenin磷酸化的水平相比野生型的細胞下降，這提示FTZ確系通過激活MEKK2發揮穩定成骨細胞內β-catenin水平，抑制β-catenin泛素化的作用。另外，已知FGF2是激活MEKK2的重要因子，而在與FTZ的比較當中提示，FTZ與FGF2所能促進MEKK2磷酸化的水平基本一致，這提示FTZ或直接或通過FGF2間接激活MEKK2活性。最后，通過Luciferase報告實驗，團隊發現FTZ與Wnt3a均可以促進β-catenin活化，當二者結合干預，可出現β-catenin活化的疊加效應，因此提示FTZ具有獨立于Wnt經典通路，通過作用于MEKK2來發揮效應的。通過與之前研究的比較發現，FTZ在分子層面的藥理作用是整體性的，即作用于Wnt通路又作用于MEKK2通路，但是二者相互獨立，又相互配合，最終起到了β-catenin去泛素化的效果。

綜上所述，FTZ可以作為一個較為理想的藥物，既促進Wnt/β-catenin通路，又通過對MEKK2的正向調控作用，避免了Wnt或其同源受體的因激活而過度冗余，消除信號傳導過程中多種混雜因子參與，減少Wnt /β-catenin通路的消極表型[19]，從而實現治療GIOP的良好作用。