絕經后骨質疏松B細胞、T細胞亞群、免疫調控因子與骨密度相關性研究

毛未賢 張萌萌 馬倩倩 高遠 宋世凱 尹紀偉

1.吉林省一汽總醫院，吉林 長春 130011 2.《中國骨質疏松雜志》社，北京 100102

女性絕經后由于卵巢功能低下，導致骨量快速丟失，骨吸收大于骨形成，引起骨質疏松。近年研究[1-2]表明，骨骼系統與免疫系統存在相互交叉、相互作用，絕經后骨質疏松由于雌激素水平下降，可通過直接或間接作用調節T淋巴細胞、B淋巴細胞分泌免疫調控因子，影響骨吸收與骨形成。成骨細胞、破骨細胞與淋巴細胞有共同的起源，在骨重建過程中T淋巴細胞、B淋巴細胞及免疫調控因子協同作用，調節骨代謝。本研究將對絕經后骨質疏松組與非骨質疏松組的B細胞(CD3-/CD19+)、T細胞亞群(調節性T細胞CD3+/CD4+/CD25+)所占比例進行研究，確定不同人群免疫細胞變化的特點。分析絕經后骨質疏松患者免疫調控因子(TNF-α、TGF-β、IL-17)的特征性改變及其與骨密度(bone mineral density, BMD)的相關性。

1 資料和方法

1.1 資料

1.1.1研究對象：從吉林省一汽總醫院門診及住院患者中篩選50～70歲絕經后女性300名，平均年齡(63.4±7.2)歲。排除患有嚴重肝、腎疾病、糖尿病、甲狀旁腺機能亢進、甲狀旁腺機能減退、甲亢、甲減、腫瘤及放化療患者；排除患有子宮肌瘤、接受過卵巢手術者及長期服用糖皮質激素治療者；排除半年內應用影響雌激素水平藥物者。記錄受試者一般情況，采用美國Hologic Discovery WA型骨密度儀檢測BMD。按照WHO關于骨質疏松的診斷標準，骨密度低于同性別峰值骨量值2.5標準差即診斷為骨質疏松。根據BMD檢測結果，將受試者分為絕經后骨質疏松組[187例,(64.9±7.6)歲]和絕經后非骨質疏松組[113例，(61.4±8.5)歲]。

1.1.2實驗儀器與試劑：美國Hologic Discovery WA型骨密度儀，美國貝克曼Navios 流式細胞儀，美國Thermo公司全自動酶標免疫分析儀；熒光標記單克隆抗體CD3-PerCP-Cyanine5.5、CD4-FITC、CD25-PE、白細胞分化抗原CD19-APC檢測試劑，均購自安捷倫生物(杭州)有限公司；TNF-α、TGF-β1、IL-17 ELISA酶聯免疫試劑盒購自聯科生物。

1.2 方法

1.2.1檢測骨密度：采用美國Hologic Discovery WA型骨密度儀檢測受試者腰椎正位(L1～4)BMD，每次開機后均用模體校正，測量誤差小于0.5%。

1.2.2采血：抽取受試者外周靜脈血10 mL，其中5 mL用EDTA或肝素抗凝，用于B細胞、T細胞亞群分析，5 mL促凝血當日離心分離血清，-20 ℃凍存，用于免疫調控因子檢測。

1.2.3流式細胞儀分析淋巴細胞亞群：利用流式細胞儀對2日內抽取的外周抗凝血進行CD3+/CD4+/CD25+調節性T細胞、CD3-/CD19+ B細胞分析。

1.2.4免疫調控因子檢測：采用美國Thermo公司全自動酶標免疫分析儀測定血清免疫調控因子TNF-α、TGF-β1、IL-17水平。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 絕經后骨質疏松組與非骨質疏松組BMD檢測結果

絕經后骨質疏松組與非骨質疏松組BMD差異顯著，結果有統計學意義。見表1。

表1 絕經后骨質疏松組與非骨質疏松組BMD檢測結果

2.2 絕經后骨質疏松組與非骨質疏松組淋巴細胞亞群檢測結果分析

絕經后骨質疏松組外周血T淋巴細胞(CD3+)、輔助性T淋巴細胞(CD3+ CD4+)百分比與絕經后非骨質疏松組比較差異無統計學意義(P>0.05)。絕經后骨質疏松組外周血B淋巴細胞(CD3-/CD19+)百分比低于非骨質疏松組，但差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 骨質疏松組與非骨質疏松組T細胞與B細胞(CD3-/CD19+)分析

2.3 絕經后骨質疏松組與非骨質疏松組調節性T淋巴細胞(CD3+/CD4+/CD25+)亞群檢測結果分析

絕經后骨質疏松組調節性T淋巴細胞亞群占CD4+T淋巴細胞的比例為(6.23 ±2.76)%，非骨質疏松組調節性T細胞亞群占CD4+T淋巴細胞的比例為(8.63 ±3.19)%，與骨質疏松組比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 骨質疏松組與非骨質疏松組調節性T細胞(CD3+/CD4+/CD25+)亞群分析

2.4 絕經后骨質疏松組與非骨質疏松組免疫調控因子(TNF-α、TGF-β1、IL-17)檢測結果比較

結果顯示，骨質疏松組血清TNF-α水平高于非骨質疏松組，差異有統計學意義(P<0.05)；骨質疏松組血清TGF-β1水平低于非骨質疏松組，差異有統計學意義(P<0.05)；骨質疏松組血清IL-17水平高于非骨質疏松組，差異有統計學意義(P<0.05)。TNF-α與腰椎(L1～4)BMD呈負相關(P<0.05)，TGF-β1與腰椎(L1～4)BMD呈正相關(P<0.05)、IL-17與腰椎(L1～4)BMD呈負相關(P<0.05)。見表4、表5。

表4 絕經后骨質疏松組與非骨質疏松組免疫調控因子(TNF-α、TGF-β1、IL-17)檢測結果比較

表5 骨質疏松組、非骨質疏松組TNF-α、TGF-β1、IL-17與腰椎(L1～4)BMD的相關性分析

3 討論

調節性T細胞(regulatory T cell，Treg)是T淋巴細胞的一個亞群，是表達IL-2可溶性受體α鏈(CD25)CD4+T細胞的一類細胞亞群[3]，在維持機體免疫平衡、介導機體免疫耐受等方面具有重要的調控作用，在抑制絕經后骨質疏松演變進程中發揮重要調節作用[4-6]。CD3+/CD4+/CD25+調節性T細胞在骨代謝中對破骨細胞起著負調控的作用，能夠抑制破骨細胞的形成與分化，降低破骨細胞的活性。目前認為CD3+/CD4+/CD25+調節性T細胞對破骨細胞的抑制作用主要通過兩條途徑實現：一是細胞間直接接觸途徑，二是免疫調控因子依賴途徑。

免疫系統和骨骼系統共享很多調節因子，如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、轉化生長因子-β(TGF-β)、白細胞介素17 (interleukin-17，IL-17)等，其中TNF-α、IL-17等在破骨細胞的增殖、分化、活化過程中發揮著正調控的作用[7]。TNF-α 是十分重要的破骨細胞激活因子，可直接促進破骨細胞前體細胞的有絲分裂及破骨祖細胞的分化[8]，刺激前祖細胞產生新的破骨細胞；也可介導基質細胞和成骨細胞分泌參與破骨細胞分化所必需的“下游”細胞因子，如M-CSF、IL-6、IL-11、RANKL等，間接促進破骨祖細胞的增殖[9]。此外，TNF-α對成熟破骨細胞的骨吸收功能也有促進作用，TNF-α可間接激活成熟的破骨細胞形成骨吸收陷窩，增強破骨細胞骨吸收功能，抑制破骨細胞凋亡[10]。IL-17是促進骨吸收的細胞因子，IL-17能直接刺激破骨細胞分化，抑制成骨細胞分化，抑制骨基質礦化，增加成骨細胞分泌RANKL[11]，抑制骨保護素(osteoprotegerin，OPG)的分泌，使RANKL /OPG 比值增大，促進破骨細胞的生成[12]。TGF-β抑制破骨細胞骨吸收，調節骨吸收區新骨的形成。TGF-β參與骨與軟骨的形成，對骨組織修復具有重要的的調節作用。TGFβ通過強大的骨形成和骨修復作用，可增加骨密度。

B淋巴細胞一方面通過分泌TGF-β來誘導破骨細胞的凋亡，另一方面是OPG的主要來源，可在T細胞刺激下，提高骨微環境中OPG水平，來抑制破骨細胞的形成[13-14]，對骨破壞具有保護作用。

T細胞及B 細胞通過影響破骨細胞分化增殖，在骨質疏松發病機制中發揮重要作用。至今，對于絕經后骨質疏松患者T細胞亞群和B細胞亞群所占比例和免疫調控因子的研究甚少。本研究探討了T細胞亞群(調節性T細胞CD3+/CD4+/CD25+)和B細胞(CD3-/CD19+)與免疫調控因子(TNF-α、TGF-β、IL-17)協同作用對骨質疏松發生、發展的影響。結果顯示，絕經后骨質疏松組調節性T淋巴細胞亞群占CD4+T淋巴細胞的比例低于非骨質疏松組(P<0.05)，絕經后骨質疏松癥女性調節性T淋巴細胞亞群有著明顯變化。說明調節性T細胞在在絕經后骨質疏松的發生、發展過程中具有重要調節作用。絕經后骨質疏松組外周血B淋巴細胞(CD3-/CD19+)百分比低于非骨質疏松組女性，但差異無統計學意義(P>0.05)。絕經后骨質疏松癥患者血清免疫調控因子(TNF-α、TGF-β、IL-17)水平與非骨質疏松女性差異明顯。絕經后骨質疏松組血清TNF-α、IL-17水平高于非骨質疏松組(P<0.05)，TNF-α、IL-17與腰椎(L1～4)BMD呈負相關(P<0.05)；骨質疏松組血清TGF-β1水平低于非骨質疏松組(P<0.05)，TGF-β1與腰椎(L1～4)BMD呈正相關(P<0.05)。

Bozec等[15]研究了調節性T細胞在骨重建與骨相關疾病(如骨質疏松癥或炎性骨丟失)中的作用及其調節破骨細胞形成的分子機制。發現Treg細胞可以通過分泌細胞因子TGF-β、IL-10、IL-4等來調節破骨細胞生成。Treg細胞也可通過細胞毒性T淋巴細胞抗原(CTLA-4)調節破骨細胞的分化，在體外和體內誘導破骨細胞凋亡，抑制破骨細胞的分化。徐玉善等[16]分析了絕經后骨質疏松患者的免疫系統變化，發現絕經后骨質疏松癥女性的T淋巴細胞、B淋巴細胞有著明顯變化，骨質疏松組T淋巴細胞較對照組減少，B淋巴細胞升高。SC等[17]調查發現由于雌激素分泌的減少，參與免疫反應的T、B淋巴細胞存活延長，其分泌的腫瘤壞死因子TNFα增多，直接或間接的作用于成骨和破骨細胞，刺激破骨細胞的形成和活化，導致骨形成和骨吸收之間的動態平衡失調，最終導致骨質疏松。江艷等[18]對不同年齡組雄性SD 大鼠調節性T 細胞的研究表明，Treg細胞占CD4+T細胞百分比與骨密度呈正相關，隨Treg數量百分比增高，骨吸收減少，骨密度值升高。研究[19]表明，調節性T細胞對雌激素的反應性更強，雌激素可以上調Treg 亞群比例。Pacifici R等[20]觀察到卵巢切除小鼠的T細胞缺陷能夠拮抗骨量的流失；而Lee等[21]發現卵巢切除小鼠的T細胞缺陷并不能阻止皮質骨的骨量流失，提示T 細胞在骨重建過程中的作用錯綜復雜。

Onal等[22]的研究發現B細胞在正常骨重建過程中發揮的作用很少，但在雌激素水平下降時，可抑制破骨細胞的分化。Breuil等[23]觀察絕經后骨質疏松患者B 淋巴細胞數目較正常對照組減少，并與骨密度負相關。Li等[24]發現T 淋巴細胞在卵巢切除后活化，其表達的共刺激分子配體CD40 L 與B 淋巴細胞表面CD40 結合，從而促進B 淋巴細胞對OPG 的產生。如果T 淋巴細胞缺陷，或無CD40 和CD40 L 的表達，小鼠將表現OPG 減少，誘發骨質疏松，表明T、B 淋巴細胞可相互作用、相互影響，從而在骨代謝調節中發揮重要作用。

IL-17主要由輔助T細胞17(Th17)分泌。IL-17 誘導破骨細胞前體、基質細胞和成骨細胞的RANKL 表達，從而促進破骨細胞分化與生成[25]。CJ等[26]研究發現IL-17 參與了絕經后骨質疏松的發病機制，抑制IL-17或其受體能減少骨量的丟失。Tyagi等[27]的研究證明，雌激素缺乏誘導IL-17生成，刺激破骨細胞的分化，在預先使用雌激素(E2) 處理后被逆轉，認為雌激素缺乏誘導IL-17生成是骨質疏松的一個新的候選發病機制。Talaat等[28]的研究說明Th17 細胞和其細胞因子鏈 IL-6、IL-17、IL-23 升高，調節性T細胞(Treg 細胞)和其細胞因子鏈IL-10、TGF-β降低，對骨質疏松的發生、發展具有重要作用。

當雌激素缺乏時，TNF-α促進OC 前體細胞的增殖分化和成熟OC 的活性，抑制OB 的形成和成熟OB 的功能，增強骨吸收，在絕經后骨質疏松癥發展中發揮重要作用。有研究[29]表明，TNF-α在絕經后骨質疏松癥患者中顯著上調，TNF-α可通過激活NF-κB促進RNAKL誘導的體外破骨細胞形成。有學者[30]經研究發現，絕經后骨質疏松患者和絕經后骨量減少者血清TNF-α和IL-6水平均明顯高于正常者，差異有顯著性。提示TNF-α和IL-6可作用于破骨細胞，刺激骨吸收作用。Zhu S等[31]對TNF-α基因敲除小鼠預防骨質流失與骨代謝調節機制中的作用研究顯示，TNF-α基因的敲除可顯著上調成骨細胞相關基因(Runx2和Col1a1)的mRNA表達，并下調破骨細胞相關mRNA抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)、基質金屬蛋白酶9(MMP-9)和組織蛋白酶K(CTSK)的表達。

TGF-β促進成骨細胞增殖、分化，Selvamurugan等[32]研究發現TGF-β信號傳導途徑是促進成骨細胞分化，刺激骨形成的重要途徑。鄧盎等[33]研究雌激素受體β基因沉默對人成骨細胞TGFβ1表達的影響，結果提示雌激素受體β可能通過調控TGFβ1和骨形態發生蛋白 2 的表達在骨代謝中發揮作用。Tian等[34]的研究指出TGF-β對于骨重建和骨骼修復是最重要的。TGF-β能刺激前成骨細胞增殖，提高細胞外基質合成，促進骨重建。

本研究對絕經后骨質疏松與非骨質疏松人群的B細胞(CD3-/CD19+)、調節性T細胞(CD3+/CD4+/CD25+)亞群的分析顯示，絕經后骨質疏松女性調節性T淋巴細胞亞群有著明顯變化，調節性T淋巴細胞亞群占CD4+T淋巴細胞的比例低于非骨質疏松女性，外周血B淋巴細胞(CD3-/CD19+)百分比低于非骨質疏松組女性，血清免疫調控因子(TNF-α、TGF-β、IL-17)水平與非骨質疏松女性相比，差異顯著。T淋巴細胞、B 淋巴細胞與免疫調控因子協同作用，通過影響破骨細胞、成骨細胞分化、增殖，調節骨重建，骨質疏松與機體免疫系統密切關聯。