褪黑素對去卵巢大鼠細(xì)胞因子水平和RANKL/OPG比值及骨密度的影響

黃成偉 潘翱

重慶市九龍坡區(qū)人民醫(yī)院藥劑科，重慶 400051

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是由于雌激素缺乏導(dǎo)致破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)和破骨細(xì)胞凋亡率降低所致。白細(xì)胞介素-17、白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子-α和干擾素-γ等細(xì)胞因子通過促進(jìn)破骨細(xì)胞生成和抑制成骨細(xì)胞分化誘導(dǎo)骨丟失，導(dǎo)致骨密度急劇下降[1]。褪黑素(melatonin，MEL)是松果腺分泌的一種神經(jīng)內(nèi)分泌激素，具有廣泛的作用，包括調(diào)節(jié)睡眠、抗衰老、抗炎和抗氧化作用[2]。研究[3]表明，褪黑激素缺乏會導(dǎo)致骨吸收增加，這表明它可能對破骨細(xì)胞相關(guān)的過程有抑制作用。有研究[4]表明血清褪黑素水平與絕經(jīng)后婦女的I型膠原相關(guān)，表明血清褪黑素水平降低與絕經(jīng)后婦女骨丟失增加有關(guān)。然而，褪黑素在骨質(zhì)疏松癥中的作用尚不完全清楚。因此，本研究的目的是研究褪黑素對骨質(zhì)疏松模型大鼠炎癥細(xì)胞因子、RANKL/OPG比值的影響，以及褪黑素對骨密度的直接影響。

1 材料和方法

1.1 研究方案

將體重相近的3月齡Sprague-Dawley(SD)雌性大鼠，行雙側(cè)卵巢切除(建立雌激素缺乏性骨質(zhì)疏松癥，OVX)或假手術(shù)(Sham)。對實(shí)驗動物按照機(jī)構(gòu)動物倫理委員會(IAEC/87)的指導(dǎo)方針進(jìn)行操作。將大鼠隨機(jī)分為4組，每組8只。A：假手術(shù)組(Sham組)，B：去卵巢組(OVX組)，C：去卵巢+β-雌二醇治療組[487.5 μg/(kg·d),OVX+E2組]，D：去卵巢+褪黑素治療組[50 mg/(kg·d),OVX+MEL組],藥物治療8周。褪黑素的實(shí)驗劑量根據(jù)先前的報告確定[2]。治療結(jié)束后，處死動物，取脛骨進(jìn)行骨密度(bone mineral density, BMD)測定，對股骨進(jìn)行細(xì)胞因子和基因表達(dá)分析。

1.2 方法

1.2.1骨密度檢測：使用DXA掃描測定大鼠脛骨骨密度、骨礦含量(BMC，g)、骨密度(BMD，g/cm2)和骨面積(Area，cm2)。將提取的骨骼清除軟組織，放入裝滿水的培養(yǎng)皿中至1 cm深。采用雙能X線骨密度儀(DXA)對感興趣區(qū)(ROI)進(jìn)行骨密度掃描，采用Hological Discovery QDR小動物高分辨率準(zhǔn)直儀進(jìn)行掃描和分析。

1.2.2基因表達(dá)分析：使用美國Sigma公司的TRIzol試劑結(jié)合PureLink RNA Mini Kit(Invitgen)從股骨近端分離總RNA。純化的總RNA用DNase I(Sigma)處理，然后按照制造商的說明使用cDNA合成試劑盒(RevertAid TM H減去First Strand cDNA合成試劑盒，美國Fermentas Life Sciences)進(jìn)行cDNA轉(zhuǎn)化。以合成的cDNA為模板，檢測RANK1、OPG、IL-23 A和IL-17 A基因的表達(dá)，并與β-肌動蛋白基因表達(dá)進(jìn)行對照。所使用的引物、登記號、產(chǎn)物大小和TM如表1所示。通過SYBR Green方法使用實(shí)時PCR對各種基因的基因表達(dá)進(jìn)行相對定量。采用比較CT法計算相對基因表達(dá)量。

表1 研究基因核酸引物序列Table 1 Sequence of oligonucleotide primers used for studying genen

1.2.3骨組織腫瘤壞死因子-α和白細(xì)胞介素-1β檢測：切開股骨近端，稱其重量。將其粉碎成粉末，懸浮在PBS(含蛋白酶抑制劑)中。混合物在7 500 r/min、4 °C下離心2 min。收集上清液，參照廠家方案(Ray Biotech用于腫瘤壞死因子-α，PeproTech用于IL-1β)用雙抗體夾心ELISA法檢測腫瘤壞死因子-α和白細(xì)胞介素-1β，蛋白質(zhì)水平使用聯(lián)苯膽酸(BCA)法測定。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。使用單因素方差分析(ANOVA)計算各組數(shù)據(jù)之間差異，并在兩組之間進(jìn)行Bonferroni分析，P值<0.05表示比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 褪黑素對去卵巢大鼠骨密度的影響

去卵巢大鼠骨密度由假手術(shù)組的0.094 g/cm2降至0.051 g/cm2。然而，當(dāng)去卵巢大鼠使用褪黑素時，骨密度增加到0.079 g/cm2。見表2。

表2 褪黑素處理對去卵巢大鼠骨密度的影響Table 2 The effect ofmelatonin treatment on bone mineral density in the ovariectomized animals

2.2 褪黑素對骨質(zhì)疏松大鼠股骨RANKL/OPG比值的影響

基因表達(dá)分析顯示，與假手術(shù)組相比，去卵巢大鼠股骨中RANKL的表達(dá)顯著增加(P<0.000 1)，而去卵巢動物經(jīng)褪黑素和β-雌二醇治療后，RANKL的表達(dá)明顯降低(P<0.000 1)，見圖1 A。雖然這些治療對OVX大鼠骨保護(hù)素(OPG)的相對基因表達(dá)沒有顯著影響(圖1B)，但與OVX組(圖1C)相比，治療組的RANKL/OPG比值顯著降低(P<0.001)。

圖1 褪黑素和雌二醇對RANKL/OPG比的影響 A：褪黑素和雌二醇治療組中RANKL基因表達(dá)的相對變化；B：褪黑素和雌二醇治療組中OPG基因表達(dá)的相對變化；C：RANKL/OPG比。注：***P<0.001。Fig.1 Effect of Melatonin and estradiol on RANKL/OPG ratio

2.3 褪黑素對骨質(zhì)疏松模型大鼠股骨IL-23和IL-17家族成員表達(dá)水平的影響

褪黑素治療去卵巢大鼠顯示IL-23的表達(dá)顯著降低(圖2 A)。分析治療組和未治療組促炎癥細(xì)胞因子IL-17 A的相關(guān)基因表達(dá)，結(jié)果顯示，IL-17 A在去卵巢動物體內(nèi)的表達(dá)增加(圖2B)。然而，β-雌二醇和褪黑素治療能有效降低去卵巢大鼠IL-17 A表達(dá)(圖2B)。褪黑素處理后IL-17B和IL-17F的表達(dá)沒有任何變化(圖2C、圖2D)。

圖2 褪黑素和雌二醇對IL-23和IL-17表達(dá)的影響注：褪黑素處理組和未處理組中IL23(A)、IL-17 A(B)、IL-17B(C)和IL-17F(D)基因表達(dá)的相對變化。Fig.2 The effect of melatonin and estradiol on the expression of IL-23 and IL-17

2.4 褪黑素對白細(xì)胞介素-1β和腫瘤壞死因子-α的影響

卵巢切除后，IL-1β和腫瘤壞死因子-α水平明顯升高。雌二醇和褪黑素均能顯著降低IL-1β和TNF-α(圖3 A、圖3B)。腫瘤壞死因子-α水平在去卵巢動物體內(nèi)升高明顯升高，褪黑素治療后則顯著降低(P<0.001)。雌二醇對腫瘤壞死因子-α水平?jīng)]有任何影響(圖3B)。

圖3 褪黑素和雌二醇治療對IL-1β和TNF-α水平的影響Fig.3 The effect of melatonin and estradiol on the levels of IL-1βand TNF-α A： IL - 1β；B： TNF-α。

3 討論

骨質(zhì)疏松癥的特征是由于骨吸收增強(qiáng)而導(dǎo)致骨量減少，骨形成降低。絕經(jīng)后雌激素缺乏或卵巢切除引起的骨骼改變可以在去卵巢嚙齒動物模型中得到很好的研究。雌激素缺乏導(dǎo)致成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞動力學(xué)失衡，導(dǎo)致骨微結(jié)構(gòu)改變。褪黑素主要在黑暗中由松果體分泌，在睡眠、晝夜節(jié)律、免疫反應(yīng)、生殖控制和腫瘤生長抑制中起關(guān)鍵作用[2]。越來越多的證據(jù)[2]表明褪黑素對骨骼健康起著有益作用。褪黑素已被證明通過激活細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2信號通路促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化[5]，更重要的是，褪黑素可以通過抑制核因子κ-輕鏈-活化B細(xì)胞輕鏈增強(qiáng)器(NF-κB)信號通路來抑制破骨細(xì)胞的分化[6]。在松果體切除的動物中，已經(jīng)觀察到BMD的下降和骨微結(jié)構(gòu)的惡化[7]。這些結(jié)果顯示褪黑素可能對骨質(zhì)疏松癥有治療效果。

DXA掃描顯示去卵巢大鼠骨密度明顯降低，提示骨質(zhì)疏松模型建立成功。去卵巢大鼠使用褪黑素治療后，脛骨骨密度明顯增加。NF-κB受體激活劑是腫瘤壞死因子家族的成員之一，由成骨細(xì)胞分泌，促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成、分化和活化，導(dǎo)致骨丟失。RANKL與破骨細(xì)胞RANK的結(jié)合受其可溶性誘餌受體—護(hù)骨素(OPG)的調(diào)節(jié)。它的表達(dá)受糖皮質(zhì)激素、甲狀旁腺素和各種細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)，如IL-1、IL-6、IL-11和腫瘤壞死因子-α[8]。在本研究中，雖然OPG的表達(dá)沒有受到影響，但在OVX大鼠中觀察到RANKL的表達(dá)顯著增加，導(dǎo)致RANKL/OPG比值凈增加。研究[9]表明，雌激素刺激OPG的產(chǎn)生，在缺乏雌激素的情況下，RANKL是參與破骨細(xì)胞形成和隨后的骨丟失的主要分子。褪黑素和雌激素治療可以恢復(fù)RANKL水平，與Sham組相似，導(dǎo)致治療動物RANKL/OPG比值降低。最近的一項研究[10]也觀察到了類似的結(jié)果，使用抗氧化劑可以降低RANKL的表達(dá)，增加了OPG的表達(dá)，表明褪黑素對去卵巢大鼠的破骨細(xì)胞分化和活性具有預(yù)防作用。

IL-17是一種促炎細(xì)胞因子，由輔助性T細(xì)胞(Th17細(xì)胞)在轉(zhuǎn)化生長因子β、IL-6、IL-1β和IL-23的作用下產(chǎn)生。IL-23是IL-12家族的成員，可誘導(dǎo)IL-17的產(chǎn)生。用抗VD3/CH28單抗刺激Th細(xì)胞，在IL-23存在下分離出分泌IL-17的Th17細(xì)胞。這些細(xì)胞在RANKL和M-CSF存在的情況下導(dǎo)致破骨細(xì)胞形成[11]。Th17細(xì)胞的確切功能在小鼠(IL-17/和IL-23/)上進(jìn)行的基因敲除研究中或在自身免疫性關(guān)節(jié)炎中使用抗IL-23抗體進(jìn)行了描述，表明Th17是治療骨骼退行性疾病的強(qiáng)大靶點(diǎn)[12]。從這些研究可以得出結(jié)論，Th17細(xì)胞通過IL-23刺激而增殖，并且在T細(xì)胞介導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成中起著至關(guān)重要的作用。卵巢切除后Th17細(xì)胞增多，通過產(chǎn)生IL-17刺激破骨細(xì)胞生成，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。IL-17還增加腫瘤壞死因子α、IL-6和RANKL的表達(dá)，這些都是由成骨細(xì)胞產(chǎn)生的促破骨細(xì)胞因子。這些效應(yīng)被雌二醇治療逆轉(zhuǎn)[13]。在本研究中觀察到去卵巢大鼠IL-17 A的表達(dá)水平升高。褪黑素治療可使去卵巢大鼠細(xì)胞因子水平顯著降低，提示褪黑素可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子IL-17 A起到骨保護(hù)作用。然而，與褪黑素治療的大鼠相比，雌二醇治療組出現(xiàn)IL-17 A水平下降更為明顯。IL-23也顯示出與Th17細(xì)胞因子相似的結(jié)果。

研究表明，IL-1、IL-6、IL-17、TNF-α等促炎細(xì)胞因子通過增加破骨細(xì)胞數(shù)量，增加骨吸收速率，參與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。IL-1β對骨吸收也有很強(qiáng)的刺激作用。IL-1β上調(diào)RANKL的產(chǎn)生，通過調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化、激活和存活來增強(qiáng)其活性并刺激破骨細(xì)胞的生成，從而導(dǎo)致骨吸收[14]。此外，IL-1β通過增加骨內(nèi)前列腺素(PGE_2)合成刺激骨吸收，上調(diào)RANKL表達(dá)，從而調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞壽命。腫瘤壞死因子α通過其在骨髓基質(zhì)細(xì)胞和破骨細(xì)胞前體細(xì)胞上的表達(dá)促進(jìn)骨吸收。腫瘤壞死因子α暴露于基質(zhì)細(xì)胞會導(dǎo)致破骨因子的產(chǎn)生，如RANKL、M-CSF和IL-1[15]。在促炎環(huán)境中，這些過程共同增加了破骨細(xì)胞的壽命和數(shù)量，導(dǎo)致骨吸收增加。IL-1、β與腫瘤壞死因子-α在炎癥性破骨細(xì)胞形成過程中關(guān)系密切。在破骨形成過程中，IL-1α上調(diào)了腫瘤壞死因子-β的許多反應(yīng)，提示完全抑制IL-1β和腫瘤壞死因子-α活性可以完全阻止骨吸收[16]。在本研究中，去卵巢大鼠骨IL-1β和TNF-α顯著升高，這可能與去卵巢誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激有關(guān)。褪黑素可顯著降低骨組織中IL-1β和TNF-α水平。這些結(jié)果提示，褪黑素對去卵巢大鼠骨吸收的抑制作用可能與其降低IL-1、β和TNF-α水平有關(guān)。

綜上，雌激素和褪黑素可調(diào)節(jié)去卵巢大鼠RANKL/OPG、IL-23和IL-17的表達(dá)。褪黑素可顯著降低去卵巢動物骨骼中IL-1、β和TNF-α的水平。但是本研究也有其不足之處，體現(xiàn)在研究時間較短以及組別較少，沒有進(jìn)一步和其他抗氧化劑藥物比較，后續(xù)將進(jìn)一步研究褪黑素改善骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制。