細胞因子配體3和絕經后骨質疏松癥嚴重程度相關性研究

趙東波 王昊 馬育林 何揚

1.珠海市人民醫院/暨南大學附屬珠海醫院內分泌科，廣東 珠海 519000 2.暨南大學第一臨床醫學院重癥醫學科，廣東 廣州 510630

絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是絕經后女性需要面臨的一種重要的代謝性骨病。雖然PMOP的病因尚不完全清楚，雌激素缺乏在PMOP的發生發展中起重要作用[1]。到目前為止，OP主要是根據股骨近端和腰椎骨密度(bone mineral density， BMD)來確診[2]。最近，已提出涉及骨轉換增加的生化標志物作為骨吸收嚴重程度的潛在指標[3]。趨化因子是參與調節細胞募集的小的可溶性化學吸引細胞因子，與細胞分化、細胞凋亡和增殖以及其他生理活動有關[4]。趨化因子細胞因子配體3(CCL3)也稱為巨噬細胞炎性蛋白-1α，是最廣泛研究的趨化因子之一。CCL3是一種具有化學吸引力的細胞因子趨化因子，對樹突細胞、單核細胞、嗜堿性粒細胞和嗜酸性粒細胞具有趨化活性。近年來，已經部分研究了CCL3在骨代謝中的作用。CCL3與其受體趨化因子細胞因子受體1結合，通過下調骨鈣素(OCN)，與runt相關的轉錄因子2(Runx2)和osterix(Osx表達)的表達來抑制礦化激活，從而抑制成骨細胞的分化、增殖和成骨潛能[5]。此外，施用抗CCL3抗體可以增加OCN、Runx2和Osx的水平，部分恢復成骨細胞的活性[5]。因此，CCL3可能在OP進展中發揮關鍵作用。然而，目前血清CCL3水平與OP疾病嚴重程度之間研究有限。因此，本研究觀察血清CCL3水平和PMOP疾病嚴重程度的相關性。

1 材料和方法

1.1 一般臨床方案

2017年9月至2019年6月，82例PMOP患者納入本研究。所有診斷均基于世界衛生組織的OP診斷標準。排除標準：存在可能導致低BMD的其他代謝性骨病，如骨軟化、甲狀旁腺功能亢進和維生素D缺乏；存在明顯的腎、肝或心血管疾病；使用降鈣素、選擇性雌激素受體調節劑或過去3個月內使用雌激素或過去6個月內雙膦酸鹽(BP)或糖皮質激素。將76名骨量正常的絕經后婦女[絕經后非骨質疏松癥(PMNOP)]和80名育齡婦女(20～49歲)作為對照組。所有參與者均簽署知情同意書。

1.2 指標檢測

在禁食過夜后的上午8:00，抽取靜脈血并快速離心，將樣品保持在-80 ℃條件下直至檢測完畢。使用定量夾心酶聯免疫吸附法通過試劑盒(Quantikine；R&；D Systems，Minneapolis，MN)檢測血清CCL3的水平。根據制造商的說明設置空白對照、標準品和樣品孔。通過標準曲線計算CCL3的樣品水平。血清白細胞介素(IL)-6(1∶1 000，Santa Cruz，USA)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α) (1∶1 000，Santa Cruz，USA)、抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP-5b) (1∶1 000，Abcam，Cambridge，UK)和1型交聯的羧基末端端肽(CTX-1) (1∶1 000，Abcam，Cambridge，UK)的水平也使用相同的檢測方案進行測試。CCL3、IL-6、TNF-α、CTX-1和TRACP-5b測定間變異系數分別為3.3%、5.2%、4.0%、3.1%和3.9%；CCL3、IL-6、TNF-α、CTX-1和TRACP-5b測定內變異系數分別為4.6%、6.6%、6.3%、7.5%和5.3%。所有樣品測試重復至少3次。

使用Oswestry殘疾指數(ODI)和視覺模擬評分(VAS)評估臨床癥狀嚴重程度。使用范圍從0(無疼痛)到100 mm(最嚴重的疼痛)的范圍評估VAS上的評分。ODI通過評估10個項目的自我管理問卷評估背部特異性功能，每個項目的點數范圍為0～5，最終得分總計在0～100個點之間。這10個項目包括疼痛強度、睡眠、站立、坐、走、舉、個人護理、旅行、工作和社交生活；分數較高的患者的疾病更嚴重。

所有受試者的BMD使用雙能量X射線吸收測定法(Prodigy Advance，General Electric Company，Fairfield，CT，USA)檢測，檢測的部位包括股骨頸、全髖和腰椎(L1-L4)，檢測結果使用g/cm2表示。

1.3 統計學分析

數據使用均數±準偏差、中位數或頻率。用Kolmogorov-Smirnov檢驗評估數據的正態性。根據數據分布，通過單向ANOVA或Kruskal-Wallis檢驗進行PMOP女性，PMNOP女性和健康對照之間的特征比較。應用Bartlett試驗檢驗組間方差同質性，用Tukey或Tamhane檢驗進行事后分析。通過Spearman相關和多元線性回歸分析調整體重指數(BMI)和年齡前后血清中CCL3濃度與BMD，臨床嚴重程度和生化指標的相關性。所有分析均使用SPSS 19.0進行，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

表1描述了所有受試者的人口統計學和臨床特征。PMOP組的平均年齡為(65.8±5.1)歲，PMNOP組為(64.9±5.7)歲，對照組為(44.9±5.0)歲。與PMNOP[(23.9±3.3)kg/m2]和對照組[(23.6±3.4)kg/m2]相比，PMOP[(24.0±3.0)kg/m2)的BMI沒有顯著差異。PMOP組血清CCL3水平顯著高于PMNOP組[(40.9±15.1)pg/mL vs (24.2±8.7) pg/mL vs (23.9±9.1) pg/mL；P<0.001]。

與PMNOP和對照組相比，PMOP組股骨頸、腰椎L1～4和全髖的骨密度顯著降低(表2)。進一步分析血清CCL3水平以確定它們與PMOP中的BMD的相關性。發現較高的CCL3水平與較低的股骨頸BMD(r=-0.329，P=0.003)，較低的總髖BMD(r=-0.345，P=0.002)和較低的腰椎L1-L4的BMD(r=-0.354，P=0.001)相關。

本研究進一步探討了血清CCL3濃度與VAS和ODI臨床嚴重程度評分的相關性，以說明CCL3是否與臨床表現有關。結果顯示血清中的CCL3水平與VAS(r=0.413，P<0.001)和ODI(r=0.360，P<0.001)顯著相關。同時發現CCL3與骨吸收標志物TRACP-5b(r=0.371，P<0.001)、CTX-1(r=0.317，P=0.004)、TNF-α(r=0.305，P=0.005)以及IL-6(r=0.288，P=0.008)呈正相關。調整年齡和BMI后，所有這些相關性仍然顯著(表3)。多元線性回歸分析表明，CCL3可作為評估BMD和臨床嚴重程度的獨立候選標志物(表4)。

表1 絕經后非骨質疏松癥、絕經后骨質疏松癥和健康對照組的人口學數據、生化指標和CCL3水平比較

表2 絕經后非骨質疏松癥、絕經后骨質疏松癥和健康對照組中股骨頸、全髖和腰椎的骨密度比較(g/cm2)

3 討論

本研究證實PMOP的女性骨密度降低的同時血清CCL3水平則升高，表明這種趨化因子與OP之間存在相關性；此外，還發現CCL3水平和VAS和ODI密切相關；CCL3水平也與IL-6、TNF-α、CTX-1和TRACP-5b密切相關。這一結果表明CCL3是PMOP婦女OP進展的重要中介因子。

表3 通過調整年齡和體重指數的絕經后骨質疏松癥女性血清趨化因子細胞因子配體3濃度與其他指數的相關性

表4 多元線性回歸分析年齡、BMI和血清CCL3與BMD、VAS和ODI的相關性Table 4 Multivariate linear regression for age, BMI, and serum CCL3 with BMD,VAS, and ODI

趨化因子是介導白細胞和其他表達G蛋白偶聯受體的細胞的激活和遷移的細胞因子[6]。基于其氨基末端保守的半胱氨酸殘基序列，有4個主要的趨化因子亞群，即CXC、CC、C和CX3C[6]。趨化因子在啟動破骨細胞激活和破骨細胞發生中是至關重要的[7]。尤其是CCL3，在破骨細胞分化過程中由RANKL誘導[8]，是誘導多發性骨髓瘤中破骨細胞形成的公認因子[5]。CCL3是巨噬細胞的趨化細胞因子，誘導破骨細胞聚集和活動[8]。本研究證明血清CCL3水平與股骨頸、全髖和腰椎L1-L4的BMD降低有關，表明CCL3可能既誘導破骨細胞活動，又導致骨量減少。

慢性背痛是PMOP最重要的并發癥之一。腰背部疼痛在骨質疏松癥患者中很常見，高達10.4%的腰背部疼痛的PMOP患者并未發現骨折[9]。此外，骨密度降低與椎骨骨折的風險增加有關，這反過來也可能導致慢性疼痛和限制背部運動[10-11]。用于治療OP(包括BP)的藥物可以通過作用于破骨細胞活性來減輕疼痛。這些發現表明OP與骨吸收和疼痛密切相關，骨吸收可能導致骨質疏松骨疼痛。CCL3證明可以調節疼痛，炎癥組織中CCL3表達的升高與急性和慢性炎性痛覺過敏和慢性機械性過敏癥密切相關[12]。此外，在慢性和復發性頸痛患者中，隨著炎性細胞因子的增加，CCL3水平顯著增加[13]。本研究發現血清中CCL3濃度的增加與VAS和ODI都呈正相關，這意味著CCL3可能參與了與破骨細胞活動相關的疼痛。

TRACP-5b作為破骨細胞活性、破骨細胞數量和骨吸收的標志物[14]。CTX-1是OP進展、骨折風險和預后的參考標志物[15]。CTX-1似乎是一種敏感、特異和快速可用的骨吸收生物標志物，可以預測PMOP患者對BP治療的反應。先前的研究發現，與健康對照組相比，PMOP患者的CTX-1和TRACP-5b明顯升高，并與BMD呈負相關[16]。同時，雌激素水平下降，炎癥標志物如IL-6和TNF-α水平增加，所有這些都加速了骨重塑周期，伴隨著破骨細胞的強烈激活和更大的骨吸收。本研究發現血清CCL3水平與升高的CTX-1和TRACP-5b水平呈正相關；CCL3與IL-6以及TNF-α水平呈正相關，進一步支持CCL3在破骨細胞活動中所起的作用以及骨轉換標志物。

本研究有一些局限性。首先，本研究設計為橫斷面研究，涉及相對較小的樣本量。第二，未評估可能參與OP進展的其他趨化因子的濃度。總之，本研究發現在PMOP中CCL3水平比健康女性更高。在PMOP中，CCL3水平與疾病嚴重程度呈正相關。