基于麥氏酸活化呋喃的魚肉新鮮度指示卡研究

李寧　肖婷　章騫　陳曉梅　陳曦

摘 要 傳統的肉類新鮮度指示卡采用pH型指示劑，受環境因素影響大，容易造成假陽性結果。本研究以麥氏酸活化呋喃 （Meldrum′s activated furan， MAF）為揮發性胺指示劑，聚氯乙烯（Polyvinyl chloride，PVC）為載體，設計了一種用于檢測魚肉新鮮度的MAF/PVC薄膜。通過旋轉涂布法制備薄膜，以NH3為模型物，考察了薄膜的傳感性能。結果表明，MAF質量含量為15%、旋轉涂布速度為2000 r/min時制得的薄膜對NH3傳感效果最好。以MAF/PVC薄膜為新鮮度指示卡，貼于裝有鮮魚肉的托盤包裝內。測定MAF/PVC薄膜的亮度（L）、紅色度（a）、黃色度（b）值，并根據MAF/PVC薄膜響應前后的L、a、b值計算色差值（ΔE）; 同時，測定魚肉樣品中的總揮發性鹽基氮（Total volatile basic nitrogen， TVB-N）含量。結果表明，MAF/PVC薄膜的ΔE值變化趨勢與樣品中TVB-N含量具有良好的相關性，可準確、快速指示魚肉的新鮮度，在水產品新鮮度檢測中具有良好的應用前景。

關鍵詞 新鮮度指示卡; 魚肉; 麥氏酸活化呋喃

1 引 言

新鮮度是評價水產品質量的重要指標之一，對水產品品質及原料的加工適性有重要影響。水產品新鮮度評價方法主要包括常規的感官評價法、微生物檢測法[1]、高效液相色譜法[2]，以及近年來發展起來的電子鼻[3]、電子舌[4]和高光譜成像法等[5]。但這些方法普遍存在樣品前處理過程復雜、操作繁瑣、成本高等缺點，難以滿足現場快速檢測的要求。相比較而言，新鮮度指示器法可以通過直觀的顏色變化反映包裝內部食品的新鮮程度，是一種小尺寸、低成本的無損檢測技術，在水產品新鮮度檢測中具有較好的應用潛力[6，7]。

食品在變質過程中，其蛋白質腐敗分解形成氨基酸后，在假單胞菌等的作用下發生脫氨、脫羧反應，產生大量揮發性胺如氨氣、三甲胺等，這些胺的存在會使包裝空間內pH值上升，研究者據此開發了一系列的新鮮度指示器。Zhang等[8]以洋紫荊花提取的天然染料作為指示劑，實現對豬肉和魚肉腐敗程度的檢測。Kuswandi等[9]以甲基紅和溴甲酚紫作為指示劑，實現對牛肉新鮮度的檢測。Dudnyk等[10]從卷心菜中提取花色苷作為指示劑，設計以果膠為載體的新鮮度傳感器，用于檢測牛肉和牙鱈的新鮮度。由于這些新鮮度指示器采用的指示劑均為pH敏感型材料，容易受到溫度、濕度、干擾氣體等環境因素的影響，造成指示劑顯色不準確。因此，開發對揮發性胺具有高特異性、靈敏響應的傳感材料，是實現準確檢測食品新鮮度的重要途徑。

給體-受體斯坦豪斯加合物（Donor-acceptor Stenhouse adducts，DASAs）是一類新穎的光敏感分子，2014年由加州大學圣芭芭拉分校Read de Alaniz課題組首次合成[11]。在長波長光（可見光或近紅外光）的作用下，DASAs可發生鏈狀與環狀變換，產生新的結構與性質。研究表明，麥氏酸活化的呋喃（Meldrum′s activated furan， MAF）可與胺類化合物發生開環反應，形成高摩爾光吸收的DASAs[12，13]，這為制備魚肉鮮度標簽提供了良好的理論依據。聚氯乙烯（Polyvinyl chloride，PVC）是一種熱塑性材料，具有無毒、重量輕、成本低及加工簡單等特性，廣泛應用于工業制品、食品包裝及化學傳感等領域[14～17]。

本研究以MAF為揮發性胺的指示劑，PVC為載體，通過旋涂法制備MAF/PVC薄膜，以NH3為揮發性胺的模型物，優化了薄膜的制備條件。利用MAF/PVC薄膜對魚肉新鮮度進行檢測，并以樣品總揮發性鹽基氮（Total volatile basic nitrogen， TVB-N）含量變化趨勢為參照，評價薄膜的檢測性能，為此薄膜的進一步推廣應用提供了實驗依據。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

S-4800掃描電子顯微鏡（日本日立株式會社）; ALPHA II傅立葉紅外光譜分析儀（德國布魯克公司）;? Easycoater 4旋轉涂布機（江陰市佳圖科技有限公司）; ME 204分析天平（梅特勒-托利多國際貿易有限公司）; 半微量凱氏定氮儀（金壇市晶玻實驗儀器廠）; Arium comfort II超純水系統（賽多利斯科學儀器有限公司）; RE52-AA旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）。

丙二酸環異丙酯（純度98%）、甲胺（純度33%）、三甲胺（純度20%）（美國Sigma-Aldrich公司）; PVC（K-value 72-71）、糠醛（純度99%）、四氫呋喃（純度99%）（上海麥克林生化有限公司）; 載玻片（鹽城飛舟玻璃有限公司）。 其它溶劑及無機鹽均為市售分析純試劑。白鯽魚、鱸魚購于廈門集美農貿市場; 實驗用水為超純水（18.2 MΩ·cm）。

2.2 實驗方法

2.2.1 MAF的制備 采用一鍋法合成MAF[11]。分別稱取961 mg丙二酸環異丙酯和1.51 g糠醛，加入純水中，75℃攪拌2 h，得到黃色沉淀。過濾，收集沉淀，用二氯甲烷溶解。將得到的溶液分別用飽和NaHSO3溶液、水、飽和NaHCO3溶液、飽和NaCl溶液萃取，有機層用無水MgSO4干燥，旋轉蒸發除去溶劑，得到亮黃色晶體。

2.2.2 MAF/PVC薄膜的制備 將0.8 g PVC加入10 mL 四氫呋喃中攪拌至完全溶解，再加入0.5～2.5 g MAF攪拌混勻，制成薄膜前驅液。將載玻片切割成2.5 cm ×2.5 cm的矩形后，分別用乙醇、丙酮和水超聲處理30 min，氮氣吹干，備用。取600 μL前驅液滴加到處理后的載玻片上，使用旋轉涂布機進行涂布，室溫干燥后，將MAF/PVC薄膜從載玻片上分離并進行裁剪。

2.2.3 MAF/PVC薄膜的微觀形貌及紅外光譜表征 用S-4800型掃描電子顯微鏡觀察MAF/PVC薄膜的表面及橫切面結構并拍照，測量前將薄膜真空濺射噴金處理，加速電壓為15 kV。

用ALPHA II型傅立葉紅外光譜儀在透射模式下測定指示膜的紅外吸收光譜， 掃描范圍為550～4000 cm-1，分辨率為2 cm-1，掃描次數為3次。

2.2.4 MAF/PVC薄膜對NH3的顏色響應 選擇NH3作為揮發性胺的模型物。首先，將5 g氨水置于50 mL密閉小瓶中，同時在氨水上方放置棉球，以保持恒定的飽和蒸氣壓，平衡過夜，得到飽和氨蒸氣。其次，將MAF/PVC薄膜置于相同規格的透明小瓶的頂部，再分別向瓶中注入不同濃度的氨蒸氣[18]。響應5 min后立即取出薄膜，在恒定照明條件下，使用數碼相機捕獲薄膜圖像。最后，利用Photoshop CS6軟件提取薄膜的亮度（L）、紅色度（a）、黃色度（b）的數值，并根據MAF/PVC薄膜響應前后的L、a、b值，按照公式（1）計算色差值（ΔE）：

其中，L1、a1、b1為薄膜響應前的數據，L2、a2、b2為薄膜響應后的數據。

2.2.5 MAF/PVC薄膜的選擇性 將MAF/PVC薄膜分別置于裝有甲胺、三甲胺、氨水、乙酸、乙醇和H2S的密閉小瓶中，5 min后取出，記錄相關數據。

2.2.6 MAF/PVC薄膜的穩定性 將薄膜浸沒在pH 2.0～12.0的緩沖溶液中，5 min后記錄相關數據; 將薄膜置于室溫下存儲，每隔兩天進行一次NH3響應實驗，記錄相關數據，持續14 d。

2.2.7 魚肉樣品新鮮度檢測 將鮮魚剔除魚頭、內臟、尾部及魚鰭部分，再用無菌刀具將魚肉切成重約30 g的長方體，將樣品置于貼有MAF/PVC薄膜的無菌培養皿中。考察薄膜在25℃和4℃對魚肉的鮮度響應。25℃下每隔12 h，4℃下每隔24 h，提取MAF/PVC薄膜的色差值。同時按照GB/T 5009.228-2016《食品安全國家標準 食品中揮發性鹽基氮的測定》[19]，利用半微量定氮法測定樣品的TVB-N含量，平行測定3次。

3 結果與討論

3.1 比色法檢測揮發胺的原理

MAF/PVC薄膜的組裝和檢測揮發性胺的原理如圖1所示。揮發性胺可與包埋在PVC材料中的MAF迅速反應，形成高度著色的DASAs，薄膜的顏色由淡黃色變為紫紅色，并且薄膜顏色變化程度與揮發性胺濃度相關，因此，通過裸眼觀察或測定MAF/PVC薄膜的色差值ΔE可對揮發性胺的濃度進行定量檢測。此外，DASAs雖是光響應染料，但當供體為堿性時（如氨、三甲胺等），染料僅在強非極性基質（如甲苯、三氯甲烷等）中才能漂白[20，21]，因此，本研究所生成的DASAs可以保持穩定的顯色。

3.2 MAF/PVC薄膜的形貌表征

MAF/PVC薄膜的表面和橫截面的掃描電鏡圖如圖2所示。由圖2A可見，室溫干燥后，薄膜表面平整，說明MAF可以均勻分散到PVC中。薄膜表面分布著較多孔洞，孔徑均一，約為2 μm，揮發性胺可通過這些孔洞，與薄膜內的MAF反應，觸發顯色。由圖2B可知，所制得的MAF/PVC薄膜橫截面光滑且均勻，表明MAF和PVC之間具有良好的相容性，厚度約為（40±1.2） μm，說明在所選擇的涂布條件下，得到的薄膜厚度均勻，這有助于MAF/PVC薄膜顯色的均一性。

3.3 紅外光譜分析

紅外光譜可以提供傳感膜表面的官能團信息，本研究分別測定了PVC薄膜、MAF以及暴露于NH3前后MAF/PVC薄膜的紅外圖譜。如圖3所示，MAF在1026、1283和1717 cm-1處出現紅外吸收峰，對應于COC對稱伸縮振動、COC不對稱伸縮振動和CO伸縮振動。將MAF包埋在PVC中，制成MAF/PVC薄膜后，薄膜的紅外吸收峰分別對應于PVC膜和MAF的特征吸收峰，表明MAF被成功包裹在PVC膜中; 同時，MAF被包埋前、后的紅外吸收峰位置未出現偏移，說明MAF分子與PVC之間不是通過化學鍵合作用連接的，很好地保留了MAF的分子結構，為后續MAF與揮發性胺反應生成DASAs提供了有利條件。比較與NH3反應前、后的MAF/PVC薄膜紅外吸收曲線，后者在1190 cm-1出現吸收峰，對應于CN伸縮振動; 在3300～3500 cm-1有一個寬的吸收帶，為NH的伸縮振動。這些數據表明，MAF與NH3發生了開環反應，生成了高摩爾吸光系數的DASAs，為后續MAF/PVC薄膜的顯色提供了依據。

3.4 實驗條件優化

3.4.1 MAF濃度的優化 為了簡化實驗，使用NH3為模型進行探究。考察了前驅液中MAF質量濃度分別為5%、10%、15%、20%、25%時制得的MAF/PVC薄膜暴露在濃度為76 mg/m3 NH3中的響應結果。在MAF含量較少時，所能形成的DASAs量較少，導致薄膜的顏色變化不明顯，ΔE值較小。當MAF質量濃度為時15%，薄膜顏色變化最明顯，ΔE=17.62±0.22。繼續提高MAF含量，黃色的MAF造成薄膜本底顏色加深，ΔE值下降，且由于PVC含量下降，MAF/PVC薄膜的韌性降低，影響了薄膜的后續使用。因此，本研究選擇MAF質量濃度為15%的前驅液。

3.4.2 旋涂速度的優化 在前驅液中MAF含量相同的情況下，控制旋涂速度分別為1000、1500、2000、2500和3000 r/min，考察所制得的MAF/PVC薄膜的厚度及其對濃度為76 mg/m3 NH3的響應情況。

如圖4所示，旋涂速度為2000 r/min時，制得的薄膜顏色變化最明顯，ΔE=17.21±0.21，結合SEM分析，此時薄膜厚度為（40.0±1.7） μm。增大旋涂速度，薄膜的厚度降低，在3000 r/min時，制得的薄膜厚度僅為（17.0±1.8） μm，且薄膜機械強度較低，很難從載玻片上完整剝離，給后續使用帶來不便。旋涂速度較低時，涂布機提供的離心力不足以使前驅液均勻分布在載玻片上，導致薄膜各處薄厚不均，影響了薄膜在顯色時的均一性，造成ΔE值誤差較大。相較而言，轉速為2000 r/min時，MAF/PVC薄膜厚度均勻，機械強度較好，且顯色最為明顯。綜合考慮，選擇旋涂速度為2000 r/min。

3.4.3 暴露時間的優化 在MAF的質量濃度為15%，旋涂速度為2000 r/min的條件下，控制MAF/PVC薄膜暴露在NH3濃度為76 mg/m3氛圍中的時間分別為3、4、5、6和7 min。隨著暴露時間延長，薄膜中的MAF與NH3發生反應，產生的DASAs增多，使得薄膜的顏色變化也隨之增大。當暴露時間到達5 min時，薄膜的ΔE=17.22±0.19，繼續延長檢測時間，MAF/PVC薄膜的顏色變化不明顯。因此，本研究選擇暴露時間為5 min。

3.5 MAF/PVC薄膜對NH3的響應曲線

圖5為在前驅液中MAF質量濃度為15%、旋涂速度為2000 r/min的條件下制得的MAF/PVC薄膜暴露于38、76、114、152、190、228、266、304和342 mg/m3的NH3中5 min后的ΔE值。NH3濃度在38～266 mg/m3范圍內與MAF/PVC薄膜ΔE值呈良好的線性關系，線性方程為ΔE=0.1478CNH3（mg/m3）- 2.9522 （R2=0.9911），MAF/PVC薄膜可以實現對38～266 mg/m3 NH3的定量檢測，對應的MAF/PVC薄膜照片如圖5插圖所示，隨NH3濃度升高，薄膜顏色由淺黃色逐漸變成紅色，且薄膜各部分顯色均勻，驗證了MAF在薄膜中分布均勻且薄膜的厚度均一。此外，根據國際照明委員會（CIE）規定，當ΔE>7時，可認為是人眼可分辨的顏色變化[22]。結合ΔE值和插圖中MAF/PVC薄膜的顯色照片，可以利用目視法直接評價76～266 mg/m3的NH3含量。

3.6 MAF/PVC薄膜的選擇性

為了考察MAF/PVC薄膜的選擇性，將薄膜分別暴露于甲胺、三甲胺、氨水、乙酸、乙醇和H2S的氣體環境中，響應5 min得到薄膜ΔE值，如表1所示。只有當MAF/PVC薄膜暴露在胺類氣氛中，其顏色才會發生顯著變化，表明此MAF/PVC薄膜具有良好的氣體選擇性，可用于揮發性胺的檢測。

3.7 MAF/PVC薄膜的穩定性

考察了pH值及濕度對MAF/PVC薄膜的影響，將薄膜浸沒在pH 2.00～12.00的各緩沖溶液中5 min，顏色均未發生變化，表明MAF/PVC薄膜不受pH及濕度的影響。

為了考察MAF/PVC薄膜的性能穩定性，將薄膜置于室溫儲存，每隔兩天進行一次NH3響應實驗，記錄相關數據。由圖 6可見，在14 d內，MAF/PVC薄膜的ΔE值幾乎不變，而在與NH3響應后的各組ΔE值的相對標準偏差為1.6%，表明在14 d內薄膜能保持較好的顯色性能。

3.8 MAF/PVC薄膜在魚肉新鮮度檢測中的應用

為了研究MAF/PVC薄膜在魚肉鮮度檢測中的應用，將MAF/PVC薄膜固定在無菌培養皿內的頂部，樣品置于培養皿內部，分別放置在25℃和4℃下貯藏，記錄薄膜的顏色變化，同時測定對應樣品的TVB-N含量，結果如圖7所示。由圖7E和7F可見，貯藏在25℃和4℃的白鯽魚和鱸魚的TVB-N含量隨貯藏時間延長而呈增長趨勢。在貯藏初期（<24 h）增長緩慢，此時蛋白質未大量分解，魚肉品質較新鮮，MAF/PVC薄膜的ΔE值變化較小。當貯藏時間超過24 h時，TVB-N的含量急劇上升，說明蛋白質大量分解，魚肉的變質速率加快，對應的MAF/PVC薄膜顏色逐漸加深（圖7A～7D）。貯藏在25℃和4℃下的白鯽魚的TVB-N含量分別在36和80 h左右達到了國標限定值[23]，此時白鯽魚不再新鮮，MAF/PVC薄膜對應的ΔE=24.36。貯藏在25℃和4℃下的鱸魚的TVB-N含量分別在39和81 h達到了國標限定值，ΔE=24.21。MAF/PVC薄膜的ΔE值與魚肉樣品中的TVB-N含量在0.01水平（雙側）上顯著相關，擬合曲線如圖8所示，線性回歸方程為C（TVB-N）=0.823ΔE+0.875（R2=0.996），表明MAF/PVC傳感膜在魚肉新鮮度檢測中具有良好的應用潛力。

4 結 論

采用PVC薄膜包埋MAF分子，在MAF質量濃度為15%、 旋涂速度為2000 r/min時，制得厚度均勻、表面平整的MAF/PVC薄膜。以MAF/PVC薄膜為NH3指示卡，可以實現對38～266 mg/m3 NH3的定量檢測， 同時對揮發性胺有較好的選擇性。將MAF/PVC薄膜應用于監測25℃和4℃貯藏條件下白鯽魚和鱸魚的新鮮度，魚肉新鮮時，MAF/PVC薄膜呈黃色; 魚肉腐敗變質時，產生較多揮發性胺，MAF/PVC薄膜呈紫紅色。MAF/PVC薄膜色差值變化與魚肉的TVB-N含量變化具有良好的相關性，可用于魚肉新鮮度的評價。 MAF/PVC薄膜易制備，成本低，無需專業檢測設備，為現場快速檢測裝置的開發提供了理論依據，在其它高蛋白食品的新鮮度檢測中也有很好的應用前景。

References

1 Miks-Krajnik M， Yoon Y J， Ukuku D O， Yuk H G.? Food Microbiol.， 2016， 53： 182-191

2 CUI Xiao-Mei， CHEN Shu-Bing， CHEN Jie， ZHU Hai-Qiang， WU Zu-Fang. Chinese J. Anal. Chem.，? 2013，? 41（12）： 1869-1874

崔曉美， 陳樹兵， 陳 杰， 朱海強， 吳祖芳. 分析化學，?? 2013， 41（12）： 1869-1874

3 Nadeem M，? Naveed T， Rehman F，? Xu Z. Microchem. J.，?? 2019，?? 144： 209-214

4 Son M，? Park T H. Biotechnol. Adv.，?? 2018，?? 36（2）： 371-379

5 Shi C，? Qian J，? Zhu W，? Yang X. Food Chem.，?? 2019，?? 275： 497-503

6 Kalpana S，? Priyadarshini S R，? Leena M M，? Moses J A，? Anandharamakrishnan C. Trends Food Sci. Technol.，?? 2019，? 93： 145-157

7 Yousefi H，? Su H M，? Imani S M，? Alkhaldi K，? Filipe C D M， Didar T F. ACS Sens.，?? 2019，?? 4（4）： 808-821

8 Zhang X，? Lu S，? Chen X. Sens. Actuators B，?? 2014，? 198： 268-273

9 Kuswandi B，? Nurfawaidi A. Food Control，?? 2017，?? 82： 91-100

10 Dudnyk I，? Janecˇek E R，? Vaucher-Joset J，? Stellacci F. Sens. Actuators B，?? 2018，?? 259： 1108-1112

11 Helmy S，? Oh S，? Leibfarth F A，? Hawker C J， de Alaniz J R. J. Org. Chem.，?? 2014，? 79（23）： 11316-11329

12 Hemmer J R， Poelma S O，? Treat N，? Page Z A，? Dolinski N D，? Diaz Y J，? Tomlinson W，? Clark K D，? Hooper J P， Hawker C，? de Alaniz J R. J. Am. Chem. Soc.，?? 2016，?? 138（42）： 13960-13966

13 Gomes R F A，? Coelho J A S，? Afonso C A M. Chem. Eur. J.，?? 2018，?? 24（37）： 9170-9186

14 Maiti S，? Bera R，? Karan S K，? Paria S，? De A，? Khatua B B. Composites Part B， 2019，?? 167： 377-386

15 Gaballah S T，? El-Nazer H A，? Abdel-Monem R A，? El-Liethy M A，? Hemdan B A，? Rabie S T. Int. J. Biol. Macromol.，?? 2019，?? 121： 707-717

16 El-Kosasy A M，? Rahman M H A，? Abdelaal S H. Talanta，?? 2019，?? 193： 9-14

17 LI Jian-Wen，? WEI Shou-Lian，? CHEN Na-Na. ?Chinese J. Anal. Chem.，?? 2017，? 45（7）： 1031-1037

利健文， 韋壽蓮， 陳娜娜. 分析化學，?? 2017，? 45（7）： 1031-1037

18 Hu Y，? Ma X，? Zhang Y， Che Y，? Zhao J. ACS Sens.，?? 2016，?? 1（1）： 22-25

19 GB 5009 228-2016，? Determination of Volatile Base Nitrogen in Food. National Standards of the People′s Republic of China

食品中揮發性鹽基氮的測定. 中華人民共和國國家標準. GB 5009 228-2016

20 Di Donato M， Lerch M M，? Lapini A，? Laurent A D，? Iagatti A，? Bussotti L，? Ihrig S P，? Medved M，? Jacquemin D，? Szyman'ski W，? Buma W J. J. Am. Chem. Soc.，?? 2017，?? 139（44）： 15598-15599